Rock可能通過抑制PI3K/Akt通路促進缺氧誘導的心肌細胞凋亡*

董家龍， 李菊香， 孫國芳， 洪 葵

(1南昌大學第二附屬醫院心內科，江西省分子醫學重點實驗室，江西 南昌 330006； 2贛州市南康區第一人民醫院心內科，江西 贛州 341400)

Rho相關的卷曲螺旋蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil protein kinase，ROCK)是新近發現的與細胞凋亡相關的激酶，是激活的caspase-3的直接裂解產物，ROCK有2個亞單位，即ROCK1和ROCK2。研究表明ROCK與心肌損傷、心肌細胞凋亡及心力衰竭有關聯[1]。然而，ROCK在缺血性心肌損傷中與磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)通路有何關系？目前尚不清楚。本研究旨在觀察缺氧誘導心肌細胞凋亡過程中，ROCK1和ROCK2的變化及其與心肌PI3K之間的關系。

材 料 和 方 法

1 材料

Sprague-Dawley乳鼠(出生1～3 d) 雌雄不限，由南昌大學醫學院醫學實驗動物科學部提供(動物合格證：醫動字 021-9602)。DMEM高糖培養基及胎牛血清(FBS)購自HyClone；胰蛋白酶購自Sigma；山羊抗鼠ROCK-1Ⅰ抗、山羊抗鼠ROCK-2Ⅰ抗、兔抗鼠caspase-3Ⅰ抗、兔抗鼠p-PI3KⅠ抗、兔抗鼠PI3KⅠ抗均購自Santa Cruz；抗α-橫紋肌肌動蛋白免疫組化試劑盒購自武漢博士德；MTS溶液購自Promega；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物有限公司

2 方法

2.1原代心肌細胞的培養及鑒定 取健康乳鼠，利用0.08%胰酶消化3次后，離心棄胰酶，接著用1%II型膠原酶消化心肌組織1～2 h，至組織消化完全，以含15% FBS的DMEM培養基(1∶1)終止消化，室溫下離心5 min，收集細胞沉淀以15% FBS的DMEM培養基充分重懸，200目濾網過濾細胞懸液至培養皿，置CO2培養箱培養，經差速貼壁2 h后，加入0.1 mmol/L 5’-BrdU抑制成纖維細胞的生長，以1×109/L的細胞密度接種于35 mm的培養皿中，待心肌細胞生長接近匯和狀態及呈現同步搏動時開始實驗。48 h后，取有心肌細胞生長的玻片，用37 ℃ PBS漂洗，4%多聚甲醛固定，加大鼠抗α-橫紋肌肌動蛋白單克隆Ⅰ抗(1∶50)，于4 ℃濕盒過夜，加FITC羊抗小鼠IgG (1∶50)，孵育30 min，PBS洗2次,DAPI染核，封片劑封片，顯微鏡下觀察。

2.2心肌細胞缺氧模型制備及各種條件培養 心肌細胞生長接近匯合狀態，呈現同步搏動時開始實驗。模擬缺血溶液(NaH2PO40.9 mmol/L, NaHCO36.0 mmol/L, CaCl21.8 mmol/L, MgSO41.2 mmol/L, HEPES 20 mmol/L,NaCl 98.5 mmol/L, KCl 10.0 mmol/L,乳酸鈉40 mmol/L， pH 6.5)以95% N2～5% CO2預飽和1 h，將培養的細胞以模擬缺血液置換正常培養基，放入密閉氣體盒中缺氧；以DMEM培養基于CO2培養箱中培養,為有氧培養。實驗分為5組：常規培養組、缺氧1 h組、缺氧3 h組、缺氧6 h組和缺氧9 h組。細胞經實驗干預后，檢測各時點相關指標：細胞凋亡率、細胞存活率及ROCK-1、ROCK-2、活化caspase-3、p-PI3K和PI3K的表達情況。

2.3MTT法檢測心肌細胞成活率 將細胞種植在96孔板中，空白調零孔只加不含細胞的培養基。實驗處理后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，繼續培養4 h，棄上清，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，酶標儀(Labststems)測定492 nm處各孔吸光度(A)值。計算細胞存活率，細胞存活率=(實驗組A/對照組A)×100%。

2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡率 用胰酶消化收集上述各組細胞， PBS洗滌細胞2次，再用500 μL的Binding Buffer懸浮細胞，分別加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，最后用FACS Calibar流式細胞儀(Beckton Dickinson，)檢測。

2.5全自動生化分析儀檢測乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH) 各組實驗干預后取心肌細胞培養液 400 μL,利用全自動生化分析儀(Beckman)測定LDH活性。

2.6Western blotting 用RIPA法取總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度，取20 μg進行SDS-PAGE分離蛋白。蛋白轉印到硝酸纖維素膜上,3% BSA液4 ℃封閉過夜。膜分別用ROCK1、ROCK2、caspase-3活化片段、p-PI3K和PI3K的Ⅰ抗 (1∶200) 孵育,4 ℃ 過夜, Ⅱ抗孵育2 h,DAB顯色照相。結果用LabWork 3.0 UVP軟件, 以目的條帶與β-actin的灰度值進行分析。

3 統計學處理

實驗均重復6次。用統計學軟件SPSS 12.0進行分析，數據采用均數±標準差(mean±SD)表示，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 心肌細胞的鑒定

倒置顯微鏡下觀察：細胞呈片狀有節律的搏動，細胞致密，高度折光，細胞核小，常有1～2個核仁，有的細胞呈不規則的星形，并伸出偽足。免疫組化結果顯示，抗體陽性心肌細胞胞漿內有綠色熒光，見圖1。

2 心肌細胞存活率、凋亡率及上清液LDH的變化

缺氧1 h、3 h、6 h、9 h后，心肌細胞凋亡率和上清液LDH活性均顯著高于對照組(P<0.01),細胞存活率均低于對照組(P<0.01),見圖2、表1。

Figure 1. Cardiomyocyte identification observed by fluorescence microscopy(×100).

Figure 2. Cardiomyocyte apoptosis induced by hypoxia at different time points.

表1 不同時點心肌細胞存活率、凋亡率和上清液LDH活性的變化

3 心肌細胞中ROCK-1、ROCK-2蛋白表達

ROCK-1在缺氧1 h 即開始升高，在6 h 表達達高峰，在9 h開始回落，均明顯高于對照組(P<0.05)。ROCK-2與在缺氧1 h即開始升高，在3～6小時表達達高峰，在9 h開始降低，均明顯高于對照組(P<0.05)，與ROCK-1的表達有平行對應關系,見圖3。

4 心肌細胞中PI3K和p-PI3K的表達

PI3K在不同的缺氧時點表達無明顯變化，差別無統計學意義。p-PI3K蛋白的表達在缺氧1 h開始升高，在3 h左右達高峰，缺氧9 h后回落，差別有統計學意義，見圖4。

Figure 3. Expression of ROCK-1 and ROCK-2 in cardiomyocytes subjected to hypoxia for different time.1： control； 2： hypoxia 1 h； 3： hypoxia 3 h； 4： hypoxia 6 h；5： hypoxia 9 h. Mean±SD.n=6. *P<0.05 vs control.

Figure 4. Expression of PI3K and p-PI3K in cardiomyocytes subjected to hypoxia for different time. 1： control； 2： hypoxia 1 h； 3： hypoxia 3 h； 4： hypoxia 6 h； 5： hypo-xia 9 h. Mean±SD.n=6. *P<0.05 vs control.

5 缺氧后心肌細胞中caspase-3蛋白表達

Caspase-3活化片段在缺氧1 h開始逐漸升高，在隨后觀察的時點內持續處于高表達狀態，與對照組比較，差別有統計學意義(P<0.01),這與心肌細胞的凋亡率和培養液中的LDH的變化是一致的,見圖5。

討 論

研究表明，ROCK 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，至少有2種亞型，即ROCK1和ROCK2。ROCK參與調節細胞的一些基本功能，如收縮、游走黏附、增殖和凋亡等[2],ROCK-1和ROCK-2幾乎在全身各組織都有表達，兩者在心臟和血管平滑肌表達均較多，ROCK-2 mRNA在大腦和骨骼肌表達較多。靜息狀態下的ROCK沒有酶活性，因為ROCK的激酶活性可能存在一種自我抑制的機制，即通過自身的折返使其催化中心(激酶域)覆蓋，這樣使得該激酶的激酶域與ATP的親和力受到抑制或使得其下游區域不能與底物結合而不被激活。ROCK的活性受細胞外信號和一些胞漿蛋白的調節,ROCK接受Rho傳遞的活化信號，發生多個氨基酸位點的磷酸化而激活，并介導其下游一系列磷酸化/脫磷酸化反應。心力衰竭和冠心病發病過程中伴隨著心肌細胞凋亡[3]，近年來，認為ROCK與心肌細胞凋亡有關系[4]。研究發現在心肌細胞中，ROCK1可以被caspase-3激活，ROCK1是活化的caspase-3的直接裂解底物，而激活的ROCK1又可以反饋激活caspase-3，如此形成惡性循環[5]。

Figure 5. The expression of cleaved caspase-3 in cardiomyocytes subjected to hypoxia for different time. 1： control； 2： hypoxia 1 h； 3： hypoxia 3 h； 4： hypoxia 6 h； 5： hypoxia 9 h. Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs control.

本研究發現，缺氧損傷能引起心肌細胞凋亡增加及引起caspase-3活化，缺氧早期可以引起磷酸化的PI3K蛋白表達增加，這可能是心肌細胞抗凋亡的的保護機制，在繼續缺氧過程中磷酸化PI3K開始下降至基本消失。與此同時，缺氧也可以引起ROCK-1和ROCK-2蛋白增加，并且在缺氧6 h左右表達達高峰，心肌細胞凋亡率也隨著缺氧時間而逐漸增加，p-PI3K在ROCK表達達高峰時開始回落， 提示ROCKs的激活可能抑制了p-PI3K的表達，進而促進了缺氧心肌細胞的凋亡。

PI3K/Akt信號通路是近年來發現參與細胞增殖調控的重要信號通路，近來研究資料表明PI3K/Akt通路是許多生命活動中關鍵的信號分子，PI3K/Akt介導的信號通路調節細胞的分裂、分化和凋亡等活動。研究發現PI3K/Akt信號途徑在缺血預適應、缺血再灌注損傷中被激活，進而抑制心肌細胞凋亡，發揮心肌保護作用。研究表明PTEN是一種磷酸(酯)酶，是新近證實的ROCK的一種底物,其可以使磷酸肌醇底物去磷酸化，在細胞內信號轉導中起了很重要的作用，尤其在PI3K/Akt信號通路中，它是PI3K上游區域的一個負性調節蛋白，與細胞生長的調節，蛋白質的合成，轉錄子的調節及細胞存活有關。PTEN可以通過ROCK而磷酸化，進而被激活。有文獻表明ROCK抑制劑保護心臟是通過抗細胞凋亡的作用，這是ROCK抑制劑減弱了缺血再灌注引起的Bcl-2下調及通過激活PI3K/Akt/eNOS途徑來保護心臟，這種保護作用可以被PI3K抑制劑LY294002完全阻斷；在心肌的局部缺血/再灌注損傷中，心肌中RhoA的表達及其后ROCK活性均有增加,在缺血再灌注早期給予ROCK抑制劑可以顯著減少SD大鼠心肌梗塞的面積及心肌細胞凋亡率[6]。綜上所述， ROCKs可能參與了缺氧致心肌細胞凋亡的過程，其機制可能是通過抑制p-PI3K信號途徑進而促進缺氧心肌細胞凋亡；ROCK可能通過激活caspase-3引起缺氧心肌細胞凋亡。

[參 考 文 獻]

[1] Fukui S, Fukumoto Y, Suzuki J, et al. Long-term inhibition of Rho-kinase ameliorates diastolic heart failure in hypertensive rats[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 2008， 51(3): 317-326.

[2] Okamoto R, Li Y, Noma K, et al. FHL2 prevents cardiac hypertrophy in mice with cardiac-specific deletion of ROCK2[J]. FASEB J, 2013， 27(4):1439-1449.

[3] 米亞非，李小鷹，江 健，等. rAAV-1SERCA2a轉染改善心力衰竭犬心功能及其機制探討[J]. 中國病理生理雜志, 2014， 30(2): 208-213.

[4] Surma M, Wei L, Shi J. Rho kinase as a therapeutic target in cardiovascular disease[J]. Future Cardiol, 2011,7(5):657-671.

[5] Chang J, Xie M, Shah VR, et al. Activation of Rho-associated coiled-coil protein kinase 1 (ROCK-1) by caspase-3 cleavage plays an essential role in cardiac myocyte apoptosis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103(39):14495-14500.

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