珠子參ISSR-PCR反應體系的建立及優化

宋小妹，許苗苗，劉銀環，王 薇，劉 超，楊新杰，崔九成(陜西中醫學院，咸陽 712046)

珠子參為五加科人參屬植物珠子參PanaxjaponicusC.A. Mey. var.major(Burk.) C.Y. Wu et K.M. Feng或羽葉三七PanaxjaponicusC.A. Mey. var.bipinnatifidus(Seem.) C.Y. Wu et K.M. Feng的干燥根莖，常用于治療氣陰兩虛、煩熱口渴、虛勞咳嗽、跌撲損傷、關節疼痛、咳血、外傷出血等癥[1]。珠子參也是民間習用特色中藥材太白七藥之一，分布于我國陜西、四川、云南、甘肅、貴州等地。目前對珠子參的研究主要集中在生藥、化學、藥效[2-7]等方面，而在植物分子生物學研究方面的報道甚少；而珠子參由于受其生長環境等因素及人為過度采挖而被列為瀕危藥用植物。因此，開展珠子參的分子生物學和遺傳學多樣性方面的研究，對珠子參種質資源保護及資源的開發利用都將產生重要影響。

簡單重復序列間區多態性標記(ISSR)是Zietkiewicz等[8]于1994年提出的一種基于微衛星(SSR)的十分有效的分子標記，具有多態性高、產率中等、重復性好、操作簡單、引物開發無需任何DNA序列信息等優點，在不同的物種間具有通用性，比較適合于基因組未測序已知DNA序列信息量小的物種使用。目前，ISSR標記已廣泛應用于植物種質資源鑒定評價、遺傳圖譜構建、重要性狀標記、進化及分子生態學等研究中[9]。本實驗旨在探索珠子參基因組DNA最優提取方法，建立和優化ISSR-PCR反應體系，為珠子參的分子鑒別提供理論基礎和技術支持。

1 儀器與試藥

1.1儀器 CT 9612型基因擴增儀(杭州柏恒科技有限公司)；DYY-10C型電泳儀(北京六一儀器廠)；UV-1800紫外檢測器(日本島津公司)；S.M-76S型凝膠成像系統(意大利BIO-RAD Lab公司)；3-18K型臺式冷凍離心機(德國Sigma公司)。

1.2試藥

1.2.1植物材料 23份樣品(1,2及12～14號為新鮮根莖，其余均為新鮮葉片)分別采自陜西、四川、云南3個主產區的10個不同地區，保存于-80℃超低溫冰箱中備用。所有樣本均經陜西中醫學院標本館王繼濤高級實驗師鑒定，其中，除10號樣本為羽葉三七PanaxjaponicusC.A. Mey. var.bipinnatifidus(Seem.) C.Y. Wu et K.M. Feng外，其余樣本均為珠子參PanaxjaponicusC.A. Mey. var.major(Burk.) C.Y. Wu et K.M. Feng。

1.2.2試劑及引物 10×PCR Buffer、MgCl2、Taq DNA聚合酶、dNTP Mixture、DL2000 DNA Marker、新型植物基因組DNA提取試劑盒(nuclean plantgen DNA kit)均購自北京康為世紀生物科技有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉均為國產分析純。所用ISSR引物參照加拿大的不列顛哥倫比亞大學所公布的序列，由上海生物工程有限公司合成。

2 實驗方法

2.1基因組DNA的提取及檢測 采用新型植物基因組DNA提取試劑盒(nuclean plantgen DNA kit)，具體操作步驟如下：

取植物新鮮組織100 mg，加入液氮充分研磨。將研磨后的粉末收集到離心管中，加入400 μL Buffer GLP1和6 μL RNase A(10 mg·mL-1)，渦旋振蕩1 min，室溫放置10 min，使其充分裂解。加入130 μL Buffer LP2，混勻，渦旋振蕩1 min。以12 000 r·min-1離心5 min，將上清液移至新的離心管中。加入1.5倍體積的Buffer LP3充分混勻。將上步所得溶液和沉淀全部加入到已裝入收集管的吸附柱中。以12 000 r·min-1離心1 min，棄去收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。向吸附柱中加入500 μL Buffer GW(使用前加無水乙醇)，以12 000 r·min-1離心1 min，棄去收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。以12 000 r·min-1離心2 min，棄去收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數分鐘，徹底晾干。將吸附柱重新放到一個新的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50～100 μL Buffer GE或滅菌水，室溫放置3 min，以12 000 r·min-1離心1 min，收集DNA溶液。-20 ℃保存備用。

采用18 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳以DL2000為標準檢測DNA完整性，在紫外分光光度計上，根據A260/A280確定DNA的質量和濃度。將檢驗合格的所有供試DNA樣品儲存在-20 ℃冰箱中，保存備用。

2.2ISSR-PCR擴增條件優化 在前期查閱資料[10-14]及預實驗的基礎上，認為影響ISSR-PCR反應的主要因素為：dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA濃度等，因此，采用L16(45)正交設計對影響ISSR-PCR反應的主要因素進行優化。影響因素水平見表1，實驗設計方案見表2。

PCR總反應液體積除表1中所列外，還包括2 μL 10×PCR Buffer，用去離子水補足到20 μL。擴增引物采用通用引物UBC818，樣品采用陜西太白縣太白山山神廟珠子參葉DNA。

表1 ISSR-PCR反應體系正交實驗因素水平表

表2 ISSR反應體系L16(45)正交實驗設計

初步設定的ISSR-PCR擴增程序為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；58 ℃退火30 min；72 ℃延伸1 min；循環40次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取10 μL擴增產物采用18 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色，置于紫外凝膠成像分析儀中觀察拍照。

2.3ISSR-PCR擴增 按照優選出的反應體系采用UBC 818對23個DNA樣品全部進行ISSR-PCR擴增。

3 結果與分析

3.1基因組DNA檢測結果 在紫外分光光度計上測定DNA的A260與A280比值在1.8～2.0之間，電泳條帶集中整齊、清晰明亮、無拖尾、無彌散，表明滿足ISSR反應對DNA質量的要求。電泳結果見圖1。

圖1 珠子參基因組DNA

3.2正交實驗結果和分析及引物篩選 瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2，依據所顯示的條帶清晰度及條帶數量等指標進行直觀分析，14號條帶擴增效果較好，即對應的表2中14號正交實驗結果較好。因此最終優化出最佳反應體系為：20 μL的PCR反應體系中含2 μL 10×PCR Buffer、10 ng模板DNA、0.25 mmol· L-1dNTPs、2 μmol·L-1引物、4 U TaqDNA聚合酶、2 mmol·L-1Mg2+。擴增程序為：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 min，72 ℃延伸1 min，循環40次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

圖2 正交實驗ISSR-PCR反應體系擴增電泳圖

3.3ISSR-PCR擴增結果 采用UBC 818對所有樣本進行擴增的結果見圖3。結果顯示，此反應體系可以給出清晰的指紋圖譜，而且，ISSR-PCR反應體系穩定可靠，可用于珠子參的分子的鑒別和遺傳關系分析。

圖3 樣品的ISSR引物UBC818擴增譜帶

4 討論

珠子參所含皂苷類、多糖類等成分含量較高，在DNA提取過程中易與DNA共沉淀，形成黏稠的膠狀物，難以溶解或產生褐變[15]。本實驗珠子參DNA基因組的提取采用了新型的提取試劑盒，不僅提取步驟簡便、效果好，而且獲得的DNA樣本純度高、雜質少，特別適合于從野外采集樣品DNA基因組的快速、高效提取。

影響ISSR-PCR擴增的因素很多。基于正交設計具有均衡分散、效應明確、綜合可比、信息量大等優點，本研究采用5因素4水平正交實驗確定了影響珠子參ISSR-PCR的引物濃度、模板濃度、Taq DNA聚合酶濃度、dNTP濃度、Mg2+濃度的最佳組合，篩選出了擴增條帶清晰、多態性豐富的ISSR引物13個，建立了穩定的、可重復的珠子參ISSR-PCR最佳反應體系及PCR擴增參數。本研究主要應用引物UBC818進行擴增，優選出的條件基本適用于其他大多數引物，但是在具體使用的過程中還要根據不同引物的特征進行適當的微調，主要調整擴增過程中的退火溫度，以期達到最好的擴增效果。

從圖2和圖3可以看出，樣品10與其他樣品DNA間差異較大。從來源得知，10號樣品為羽葉三七，雖然與珠子參同為竹節參的變種均作為珠子參藥用，但是從分子水平角度初步說明二者間有一定差異。

目前對珠子參從DNA層面展開的研究較少，前人對珠子參的ISSR-PCR分子標記技術研究很少，很多東西無從借鑒，這就為珠子參的更深入的研究帶來一定的難度。本研究針對珠子參ISSR-PCR反應體系的研究，為珠子參種質資源的保護、遺傳多樣性的研究、藥效成分的體內代謝和人工規模化栽培珠子參奠定了一定的基礎。

參考文獻：

[1] 國家藥典委員會.中國藥典2010年版[S].一部. 北京：中國醫藥科技出版社，2010：254.

[2] 王薇，李峰，宋小妹. 不同產地珠子參生藥鑒定研究[J]. 時珍國醫國藥，2010，21(6)：1468-1469.

[3] 宋小妹，劉越，蔡寶昌. 珠子參的化學成分[J]. 沈陽藥科大學學報，2010，27(8)：626-629.

[4] 宋小妹，楊新杰，王薇，等. 珠子參的HPLC指紋圖譜及模式識別研究[J]. 中國實驗方劑學雜志，2011，17(11)：59-61.

[5] 張志清, 山學祥, 李東明, 等. 珠子參、羽葉三七規范化栽培生物學研究[J]. 云南中醫藥雜志，2011,32(9)：34-36.

[6] 張志清，曹蕾，宋亮，等. 珠子參類藥物歷史沿革與應用展望[J]. 云南中醫中藥雜志，2012，33(9)：68-71.

[7] 宋小妹，李淵源，宋蓓. 珠子參不同藥用部位微量元素分析[J]. 西北藥學雜志，2011，26(2)：79-81.

[8] Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat(ISSR)anchored polymerasechain reaction amplification[J]. Genomics，1994，20：176-183.

[9] Pradeep Reddy M，Sarla N，Siddiq E A．Inter-simple sequence repeat ( ISSR) polymorphism and its application in plant breeding[J]. Euphytica，2002，128: 9-17.

[10]楊翠芳，陳伯倫，黃誠梅，等. 大果油茶基因組DNA 提取及ISSR 反應體系建立[J]. 南方農業學報，2011，42(3)：233-235.

[11]汪琛穎，趙建成. 真蘚科植物ISSR-PCR反應體系的優化及ISSR指紋圖譜的初步構建[J]. 安徽農業科學，2011，39(27)：16490-16493.

[12]王文峰，李毅，馬彥軍，等. 青海云杉ISSR-PCR反應體系的建立與優化[J]. 安徽農業科學，2009，7(21)：9868-9871.

[13]龐赫，郭太君，胡志軍，等. 大花君子蘭ISSR-PCR反應體系的建立與優化[J]. 吉林農業大學學報，2010，32(2)：167-171.

[14]劉峰，顧志敏，陳析豐，等. 長春花ISSR-PCR反應體系的正交優化[J]. 安徽農業科學，2010，38(5)：2261-2262，2267.

[15]黃曉丹，張云貴，應鐵進. 高質量植物基因組DNA的提取[J]. 植物生理學通訊，2006，42(2)：311-314.