蒙古山蘿卜有效成分的分離、鑒定及含量測定

白音夫，周雪梅，周長鳳，李德良，馮國慶，任小偉(.內蒙古自治區中蒙醫研究所，呼和浩特 0000；.內蒙古自治區食品藥品檢驗所，呼和浩特 00070)

蒙古山蘿卜ScabiosacomosaFisch的花卉，為蒙醫藥治療肝病的藥材。蒙醫認為，該藥微甘、性涼，入肝、肺經，有清肝明目、祛火消積功效，用于肝熱癥、肝中毒、肝性消瘦、黃疸性肝炎，該藥與其他藥材配伍，可治療多種肝臟疾病[1]。實驗發現，該藥可以提高小鼠血清溶菌酶、巨噬細胞溶菌酶、巨噬細胞酸性磷酸酶和巨噬細胞殺傷李斯特桿菌的活性；降低大腸桿菌內毒素的毒性；有解熱、消炎作用；抗氧化、防治肝損傷與肝纖維化作用[2-5]。由于主要成分不明確，在蒙藥藥材標準中暫無測定方法[6]。本文對其主要成分分離、鑒定，在此基礎上建立含量測定方法[7]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；TJ-912型色譜分析平臺(太極計算機公司)；IN-180型柱溫箱(上海英泰科技研究所)；SH6150D超聲波清洗器(上海昆山儀器有限公司)；電子天平(梅特勒托利多儀器有限公司)。

1.2試藥 綠原酸對照品由中國藥品生物制品檢定所提供；乙腈、甲醇為色譜純；其余試劑為分析純。研究用蒙古山蘿卜由呼和浩特市藥材站提供；測定樣品于2007年9月～2011年9月中旬采集于內蒙不同山區，采集的樣品及時干燥，避光保存。

2 方法與結果

2.1結構分析

2.1.1提取 取蒙古山蘿卜粉碎過60目篩，稱取100 g，加800 mL石油醚(60～90 ℃沸程)回流提取1 h；藥渣晾干，加水1 000 mL回流1 h，提取液趁熱濾過，濾液放冷，加乙醇至體積分數為80%，攪拌，靜置24 h;取上清液，濾過，減壓回收乙醇并濃縮成清膏，低溫干燥，粉碎成細粉；加200 mL乙酸乙酯超聲處理，濾過，取濾液，蒸干，殘渣加甲醇10 mL使其溶解，備用。

2.1.2薄層的制備與樣品的分離 取硅膠G，加質量分數1%羧甲基纖維素鈉，照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)制成(1.5 mm×200 mm×200 mm)的薄層板，備用。展開劑：乙酸乙酯-甲酸-水(7∶2∶3)上層液。線性點樣，展距140 mm，晾干，置于紫外燈(356 nm)下切割產生熒光區域的硅膠，用甲醇提取，過濾，蒸干甲醇，得白色結晶。

2.1.3鑒定 UVλmxaMeOHnm 330，244，220。IRvmaxKBrcm-13 400(-OH)，1 708(C=O)，1 660，1 640，1 620，985，835。MS：m/z354(M+)，180，163，130。HNMRδ6.25(1H，d，J=15.9 Hz，H-α)，6.82(1H，d，J=8.2 Hz，H-5)，6.97(1H，dd，J1=8.2 Hz，J2=2.1 Hz，H=67)，7.21(1H，d，J=2.1 Hz，H-2)，7.52(1H，d，J=15.9 Hz，H-β)。Rf、HPLC-tR值與綠原酸相同，UV、IRv圖譜與綠原酸一致，確定結晶為綠原酸。

2.2含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱Kromasil C18(200 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-3 mL·L-1磷酸溶液(12∶88)；流速：1 mL·min-1；溫度：30 ℃；檢測波長328 nm；進樣量10 μL，在此條件下待測組分可達到基線分離[1]。樣品中綠原酸與其他組分有較好的分離，見圖1。

2.2.2標準曲線制備 精密稱取干燥至恒質量的綠原酸對照品適量，置于棕色量瓶中，用甲醇溶解，配制成1 mL含0.28 mg綠原酸溶液，作為對照品溶液。分別精密量取綠原酸對照品溶液0.25，0.5，1，2，3，4和5 mL，置于10 mL量瓶內，用甲醇稀釋至刻度，按上述色譜條件進行測定。結果，在質量濃度7～140 μg·mL-1范圍內以峰面積(A)與對照品質量濃度(C)進行回歸，其線性關系良好。回歸方程：A=5 452.5+7 008.4C，r=0.999 0。

2.2.3供試品溶液制備 精密稱取蒙古山蘿卜藥材0.2 g，置于50 mL具塞磨口瓶內，加甲醇10 mL，稱質量，超聲處理30 min，放冷，稱質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液備用，即得。

圖1 HPLC圖

2.2.4精密度實驗 精密抽取對照品溶液10 μL，按上述色譜條件，連續進樣6次，測得綠原酸峰面積的RSD為0.41%。

2.2.5穩定性實驗 取同一供試品溶液，分別于0，1，2，4，8和12 h進樣，以綠原酸峰面積值計算RSD為0.71%。結果表明，供試品溶液在12 h內穩定。

2.2.6重復性實驗 精密稱取樣品6份，每份約0.2 g，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件進行分析，并計算含量，綠原酸含量的平均值(n=6)為3.20 mg·g-1，RSD為1.33%。

2.2.7回收率實驗 取上述含量的同批樣品6份，每份約0.12 g，置于50 mL量瓶中，依次分別加入0.1 mL(1 mL含綠原酸4.20 mg)對照品溶液，揮去溶劑，按供試品溶液的制備操作，測定含量，計算回收率。綠原酸平均回收率為101.2%，RSD為2.6%。

2.2.8樣品測定 精密稱蒙古山蘿卜藥材，按以上確定的方法制成供試品溶液，測定樣品中的含量，不同產地樣品中綠原酸含量分別為：呼和浩特蠻漢山0.242%，呼和浩特大青山0.278%，呼和浩特圣水梁0.360%，烏蘭察布輝騰梁0.431%，呼倫貝爾紅花爾基林場0.164%。

3 討論

本文通過制備薄層分離蒙古山蘿卜成分，經鑒定為綠原酸，在此基礎上建立HPLC法測定藥材中綠原酸含量的方法。對內蒙古不同產地的蒙古山蘿卜中的綠原酸含量進行了分析，發現不同產地藥材含量差別較大，可見氣候條件對藥材成分的影響。由于蒙古山蘿卜是蒙醫藥治療肝性疾病的特色藥材，長期以來無含量測定方法，本實驗研究為蒙古山蘿卜建立含量測定標準，填補了空白，可為深入研究開發蒙古山蘿卜提供參考數據。

蒙古山蘿卜成分已有研究報道，但成分中未見綠原酸報道[8]。綠原酸具有多種活性，是藥品、保健品原料。根據藥材中綠原酸含量高低可基本確定藥材品質和療效。

用本法測定蒙古山蘿卜中的綠原酸含量，其特點是樣品預處理簡單，回收率穩定，重復性好，可作為藥材的質量評價方法。

參考文獻：

[1] 內蒙古衛生局.內蒙古中草藥[M].呼和浩特：內蒙古人民出版社，1972: 158-159.

[2] 田國才，劉朝，沈敬華，等. 蒙古山蘿卜總黃酮激活小鼠腹腔巨噬細胞的動態研究[J].中華微生物學和免疫學雜志，1986，6(2): 107-111.

[3] 于潔，李希賢.蒙藥蘭盆花總黃酮對家兔外周血白細胞的影響[J].內蒙古藥學，1986，4(1): 27-29.

[4] 白音夫，李銳峰，顧維章.蒙古山蘿卜總黃酮解熱、消炎、鎮痛作用研究[J].內蒙古藥學，1987，5(1): 43-45.

[5] 武桂枝，白音夫，常亮. 蒙古山蘿卜酸對免疫性肝炎的保護及免疫調節[J].中國民族醫藥雜志，2007， 13(4): 55-56.

[6] 國家藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準:蒙藥分冊[S]. 1998: 52.

[7] 劉放，陳冰冰，吳小平.HPLC法測定菊花中綠原酸的含量[J].西北藥學雜志，2010，25(5): 350-352.

[8] 王乃利，白玉霞，樊崢嶸，等.蒙古山蘿卜活性成分的研究[J].中草藥，1989，20(6): 7-9.