桔梗中總黃酮的提取工藝優化

譚玲玲，王 忠，胡正海(.青島農業大學生命科學學院/山東省高校植物生物技術重點實驗室， 青島 26609；2.西北大學生命科學學院， 西安 70069)

桔梗(Platycodongrandiflorum(Jacq.) A.DC.)為桔梗科(Campanulaceae)桔梗屬(Platycodon)多年生草本植物，是一種兼有食用、藥用、觀賞價值的植物，其藥用部位為根[1]。《神農本草經》中已記載：桔梗性平，味苦、辛[2]，有止咳、祛痰、宣肺、排膿等作用[3]。近年來，國內外學者對桔梗的化學成分、藥理作用及臨床應用等各方面進行了深入研究。研究表明，桔梗含有多種化學成分，其主要藥用成分為總皂苷，還含有黃酮類化合物、多糖及脂肪酸等。其中的黃酮類化合物具有廣泛的生物活性，如增強心血管系統活性、抗菌及抗病毒活性、抗腫瘤活性及抗氧化自由基活性等[4]。因此，本實驗利用超聲波，以乙醇作為提取溶劑對桔梗中總黃酮的提取工藝進行了研究。實驗以總黃酮含量為指標，采用正交實驗，考察了乙醇體積分數、超聲時間及超聲次數對總黃酮得率的影響。以蘆丁為對照品，采用紫外分光光度法，在510 nm處測定提取液的吸光度，計算、比較總黃酮的提取效果，篩選出提取桔梗總黃酮的最佳提取條件，為桔梗藥材的進一步開發利用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 AR1530電子天平(美國奧豪斯儀器(上海)有限公司)；KQ-3200DB型超聲提取儀(昆山市超聲儀器有限公司)；菲恰爾GL-16A型離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司)；XMTD-2MA型電熱恒溫水浴箱(龍口市先科儀器公司)；UNICO UV-2000型紫外可見光分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司)。

1.2試藥 實驗用桔梗采自山東省淄博市博山區池上鎮，經青島農業大學初慶剛教授鑒定為桔梗科桔梗屬植物桔梗。選取健康植株的根、莖、葉，烘干、粉碎，過40目篩。樣品測定前經60℃ 烘干15 h，取出，置于干燥器中冷卻至室溫備用。

蘆丁對照品購自成都思科華生物技術有限公司(質量分數>98%)；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉等均為分析純。

2 方法與結果

2.1因素及水平考察 根據桔梗總黃酮的理化性質，選取乙醇體積分數(A)、超聲時間(B)和超聲次數(C)3個因素，每個因素選擇3個水平，設定因素水平表，見表1。

表1 正交實驗因素水平表

2.2桔梗總黃酮的測定

2.2.1對照品溶液配制 精密稱取蘆丁對照品7.26 mg，置于50 mL量瓶中，加入體積分數70%乙醇，在沸水中溶解后，再用體積分數70%乙醇定容至刻度，搖勻，即得0.145 2 mg·mL-1的對照品溶液。

2.2.2標準曲線的繪制 精確量取0.145 2 mg·mL-1的對照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL，分別置于50 mL量瓶中，分別加入體積分數70%乙醇5.0，4.0，3.0，2.0，1.0和0 mL，再加入50 g·L-1亞硝酸鈉溶液0.7 mL，搖勻，靜置6 min；再加入100 g·L-1硝酸鋁溶液0.7 mL，搖勻，靜置6 min；再加入40 g·L-1氫氧化鈉溶液5 mL，搖勻。最后用體積分數70%乙醇定容，30～40 ℃水浴箱中顯色15 min。以試劑空白作為對照，在510 nm處分別測定其吸光度。以吸光度為橫坐標、以對照品質量濃度(μg·mL-1)為縱坐標，得到回歸方程為Y=67.357X+0.182 5(r=0.998 8)，結果表明，蘆丁質量濃度在2.904～14.52 μg·mL-1范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.2.3精密度實驗 精確吸取質量濃度為0.145 2 mg·mL-1的蘆丁對照溶液2.0 mL，6份，具體操作見2.2.2標準曲線的繪制，分別測定6次吸光度。RSD為1.25%(n=6)，表明本方法精密度良好。

2.2.4桔梗總黃酮樣品的提取 準確稱取樣品2.0 g，置于離心管中，將一定體積分數的乙醇作為提取溶劑，置于超聲儀中超聲一定時間。超聲完畢后，在4 ℃下離心20 min(轉速為1200 r·min-1)。超聲完成后，對提取液進行過濾，濾液置于50 mL量瓶中，以同樣體積分數乙醇定容，搖勻。即為待測的樣品提取液。

2.2.5樣品含量測定 精密量取各樣品提取液10 mL，按2.2.2標準曲線的繪制項下方法測定其吸光度值，依據標準曲線，計算樣品中總黃酮的含量。

2.3正交實驗及結果 選取乙醇體積分數、超聲時間和超聲次數3個水平為主要考察因素，以總黃酮吸光度為考察指標，采用L9(34)正交表進行實驗，每組實驗重復3次取平均值。正交實驗方案中總黃酮的吸光度測定結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 L9(34)正交實驗設計及結果

表3 方差分析結果

由表2可以確定，利用超聲提取法提取桔梗中總黃酮的最佳條件為A3B3C3，即乙醇體積分數70%、超聲時間50 min、超聲次數3次，桔梗總黃酮的提取效果最好。根據極差R的大小，可以判斷各因素對實驗指標的影響主次。R值越大，表示對指標的影響越大。由表2分析可知，各因素對桔梗中總黃酮提取率的影響程度依次為C(超聲次數)>A(乙醇體積分數)>B(超聲時間)。

由表3可知，其中超聲次數對桔梗中總黃酮的提取的影響顯著(PC=0.036<0.05)；而乙醇體積分數(PA=0.105>0.05)和超聲時間(PB=0.204>0.05)對桔梗中總黃酮的提取的影響不顯著。

2.4最佳提取條件下桔梗根、莖、葉中總黃酮的含量 在最佳提取條件下，分別對桔梗根、莖、葉中的總黃酮的含量進行測定，結果表明，桔梗根、莖、葉中總黃酮的含量分別為0.027%，0.039%和0.26%。

3 討論

本實驗中使用超聲波對桔梗營養器官中的總黃酮進行高效地提取，提取效果較好，并且采用紫外分光光度法測定桔梗中總黃酮的含量，方法簡單可行，易于操作。通過正交實驗方案對影響桔梗中總黃酮提取的因素(乙醇體積分數、超聲時間、超聲次數)進行了研究，并得到了最佳工藝條件為A3B3C3，即乙醇體積分數70%、超聲時間50 min、超聲次數3次，桔梗總黃酮的提取效果最好。該提取工藝具有操作簡單、提取率高等優點，因此，可以作為提取桔梗中總黃酮的優選方法。

同時，利用最佳實驗條件對桔梗根、莖、葉中總黃酮的含量進行了測定，結果表明，桔梗中總黃酮主要集中在葉中。結果提示我們對桔梗中總黃酮物質的開發利用應重點選擇葉片。這與譚玲玲[5]等對狹葉柴胡、王孟歌[6]等對山楂及李文芳[7]等對甘薯中總黃酮含量的研究結果相一致。在上述這些植物中，總黃酮均主要集中在葉中。目前，含有黃酮類化合物的植物雖然分布較為廣泛，但是受到資源、產量、栽培條件等因素的限制，不能廣泛獲取原材料[8]。從傳統的中藥學方面來看，桔梗和狹葉柴胡入藥的主要是根，山楂入藥的主要是果實，甘薯入藥的則是塊莖，一般很少會用到葉子。目前，這些植物的葉子基本上是作為廢棄物被丟棄，如果能利用現代科學技術，對桔梗、狹葉柴胡、山楂、甘薯等植物的藥用部分采收時，采摘其葉進行深加工，從中提取黃酮類化合物，不僅能夠變廢為寶，而且有利于農民的增收，有著十分重大的經濟和現實意義。

參考文獻：

[1] 江蘇新醫學院.中藥大詞典[M].上海：上海科學技術出版社，1997: 289.

[2] 譚玲玲，彭化勝，胡正海. 桔梗的生物學特性及化學成分研究進展[J]. 南方農業學報， 2011，42(12)：1523-1527.

[3] 陸文總，楊亞麗，賈光鋒，等.桔梗多糖對U-14宮頸癌抗腫瘤作用的研究[J].西北藥學雜志，2013，28(1)：43-45.

[4] 武博，劉萍. 桔梗的現代研究進展[J].中國藥物應用與監測，2008，5(2)：1-3.

[5] 譚玲玲，蔡霞，胡正海.狹葉柴胡中黃酮類化合物含量及其動態變化研究[J].南方農業學報，2012，43(2)：223-226.

[6] 王孟歌，田寶娟，喬鳳霞.山楂葉中總黃酮含量的測定[J].光譜實驗室，2006，23(4)：1-3.

[7] 李文芳，田春蓮，黃美娥，等.甘薯葉和莖中黃酮類化合物含量的初步測定[J].中國農學通報，2005，21(4)：1-3.

[8] 李政浩，羅倉學.甘薯生產現狀及其資源綜合應用[J].陜西農業科學，2009(1): 75-77.