HPLC法測定結核病患者血漿中異煙肼、吡嗪酰胺、利福平和左氧氟沙星的質量濃度

錢智磊，張 亮，周秋云，陸 磊，丁紅梓，王 潔(南京市胸科醫(yī)院藥學部，南京 210029)

結核病(tuberculosis，TB)是嚴重危害人民群眾健康的呼吸系統(tǒng)傳染病，被列入我國法定重大傳染病。近20余年來，多耐藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)及廣泛耐藥結核病(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)的流行，使得包括我國在內的各國抗癆事業(yè)再次面臨嚴峻的挑戰(zhàn)[1]。2011年，全球有63萬人被確診為MDR-TB，其中MDR-TB在初治及復治結核患者中的檢出率分別為3.7%和20%。我國是27個MDR-TB流行國家中最嚴重的國家之一。此外，有84個國家已發(fā)現(xiàn)XDR-TB，占MDR-TB病例的9%[2]。

異煙肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampicin，RFP)、吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)是用于結核病患者初始治療的基本藥物，大部分患者都可以得到良好的治療效果。然而，越來越多的患者(包括初治及復治)對以上藥物中的1種或多種耐藥，使得結核病的治療變得更加復雜，增加了病死率。WHO公布的耐藥結核病規(guī)劃管理指南(2011年版)指出，對于MDR-TB患者，推薦使用氟喹諾酮類和乙硫異煙胺[3]。目前，最有效的氟喹諾酮類藥物的活性由強至弱依次是:莫西沙星>左氧氟沙星>氧氟沙星，考慮到經濟因素，以選擇左氧氟沙星(levofloxacin，LVFX)為宜。但是，臨床有報道，大約有2%～5%結核患者按標準治療方案和劑量給藥，療效仍然不理想甚至治療失敗，研究證實這些患者的血藥質量濃度遠低于普通病例平均血藥質量濃度[4-5]；同時，傳統(tǒng)的抗結核治療藥物易造成肝功能異常等不良反應[6]，導致治療中斷，進而影響患者的治療。因此，臨床對于這些病例進行血藥質量濃度治療監(jiān)測成為必要，通過血藥質量濃度的監(jiān)測，可以較好地減少不良反應的發(fā)生，保證療程的實施，提高治療效果。本研究團隊在長期進行結核病患者抗結核藥物血藥質量濃度監(jiān)測的基礎上[7-9]，進一步建立了同時測定結核病患者血漿中異煙肼、吡嗪酰胺、利福平和左氧氟沙星的血藥質量濃度的HPLC法，結果表明，本方法準確、快速、經濟，適合臨床推廣。

1 儀器與試藥

1.1儀器 高效液相色譜系統(tǒng)(液相泵LC-20AB，PDA紫外檢測器SPD-M20A，島津，日本)；高速離心機(TG1650-WS，上海盧湘儀)；艾本德微量移液器(Eppendor，德國)；電子分析天平(EB224，上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；渦旋儀(WH-2，上海滬西分析儀器有限公司)。

1.2試藥 異煙肼對照品(批號100578-200401)、吡嗪酰胺對照品(批號100178-200403)、利福平對照品(批號130496-200702)、左氧氟沙星對照品(批號130455-200202)，均為中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇、乙腈(Merck公司，德國)均為色譜純；磷酸二氫鉀、三乙胺(國藥集團化學試劑有限公司，中國)均為分析純；水為自制純化水(Milli-Q Academic，MILLIPORE公司，美國)。

2 方法

2.1色譜條件 色譜柱：島津Inertsil ODS-SP(150 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：40 ℃；檢測波長：異煙肼261 nm、吡嗪酰胺268 nm、利福平340 nm、左氧氟沙星294 nm；流動相：A.甲醇，B.乙腈，C.0.05 mol·L-1KH2PO3水溶液(三乙胺調pH 6.0)，梯度條件(含次針預平衡時間)見表1；進樣量：20 μL。

表1 異煙肼、吡嗪酰胺、利福平和左氧氟沙星的HPLC梯度條件

2.2對照品溶液的配制 精密稱取一定量的各對照品，置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，制成質量濃度分別為INH 1 000 μg·mL-1、PZA 1 000 μg·mL-1、RFP 1 000 μg·mL-1和LVFX 1 000 μg·mL-1的儲備液。儲備液于4 ℃冰箱保存。臨用前以甲醇稀釋成各種質量濃度的對照品溶液。

2.3樣品處理方法 取血漿樣品300 μL，置于2 mL離心管中，加甲醇700 μL，旋渦混合1 min，以15 000 r·min-1離心10 min，取上清液20 μL進樣。

2.4方法專屬性實驗 按2.3項下操作，同法處理人空白血漿、對照品溶液加空白血漿和同時服用4種藥物患者血漿樣品。INH(通道一261 nm)、PZA(通道二268 nm)、 RFP(通道三340 nm)、LVFX(通道四294 nm)。

2.5標準曲線制備 取空白血漿8份，加入對照品儲備液使各對照品質量濃度為0.2，0.4，0.8，1.6，3.2，6.4，12.8和25.6 μg·mL-1。按2.3項下操作，同法處理血漿進樣。以樣品質量濃度為橫坐標、以對照品的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，以樣品質量濃度和峰面積進行回歸計算。

2.6精密度與回收率 精確配制低，中，高(0.75，7.5和15 μg·mL-1)的含4種藥物的血漿樣品，按2.3項下操作，同法處理血漿進樣。計算加樣回收率、日內及日間精密度。

2.7重復性與穩(wěn)定性

2.7.1重復性實驗 取同一質量濃度的儲備液，重復5次取樣制備供試品溶液，測定，計算標準偏差。

2.7.2穩(wěn)定性實驗 取低、中、高(0.75，7.5和15 μg·mL-1)的血漿對照品樣品，分別于0，1，2，4，8和12 h內測定，計算標準偏差。

3 結果

3.1方法專屬性實驗結果 4種藥物分離的峰形良好，內源性物質無干擾，INH(通道一261 nm)、PZA(通道二268 nm)、RFP(通道三340 nm)、LVFX(通道四294 nm)的保留時間分別為4.7，5.6，12.6和13.9 min。見圖1。

3.2標準曲線與線性范圍結果 本方法線性關系良好，線性范圍可以基本包括結核病患者的血藥質量濃度范圍。見表2。

表2 INF，PZA，RFP和LVFX的回歸方程與線性范圍

圖1 HPLC圖

3.3精密度與回收率結果 按2.6項下操作，各結果均符合規(guī)定。見表3。

表3 回收率與精密度測定結果

3.4重復性與穩(wěn)定性結果 按2.7項下操作，結果重復性RSD為1.72%，穩(wěn)定性RSD為1.69%，表明該方法的重復性及穩(wěn)定性良好。

3.5患者血藥質量濃度 選取同時口服4種藥物5 d以上的患者5例，利福平0.45 g于早餐前30 min服用，異煙肼0.3 g和吡嗪酰胺0.5 g于餐后30 min服用，左氧氟沙星0.5 g于餐后60 min服用，用抗凝管采集病人服用異煙肼、吡嗪酰胺2 h后的靜脈血，以10 000 r·min-1離心10 min，分取血漿，置于離心管中，保存于低溫冰箱，備用。按 2.3項下操作，測定5名患者血藥質量濃度，數(shù)據(jù)均在線性范圍內，見表4。

表4 患者血藥質量濃度測定結果

4 討論

本課題組比較了液液萃取法、甲醇沉淀吹干復溶法、固相萃取法和本方法采用的甲醇沉淀上清液直接進樣法，發(fā)現(xiàn)液-液萃取法的線性關系和精密度均不理想，而甲醇沉淀吹干復溶法需添加抗氧化劑，且耗時較長，不能滿足臨床報告需求。固相萃取法效果理想，但是成本較高，綜合成本超過物價局收費規(guī)定，不適合醫(yī)院常規(guī)開展檢測工作。相對而言，甲醇沉淀上清液直接進樣法減少了濃縮步驟；對方法靈敏度有影響，但是操作簡單，平行性好，所需時間及成本均較少，便于臨床開展。

目前報道的多組分抗結核藥物的同時測定往往應用離子對試劑[10]，導致需要較長的柱平衡時間，且實驗重復性較差。同時，離子對試劑價格較高，且對色譜柱的損害較大，導致成本偏高，不適合醫(yī)院常規(guī)使用。本方法在流動相的選擇上避免了應用離子對試劑，選擇了常規(guī)緩沖鹽體系，雖然在分離度方面略微低于離子對試劑，但仍然能夠達到專屬性實驗的要求，降低了檢測成本，有利于臨床工作的常規(guī)開展。

在前期研究中本課題組對不同固定相的色譜柱進行了篩選[9]，本次研究在此基礎上對色譜柱的柱長和填料粒徑進行了考察。發(fā)現(xiàn)250 mm的色譜柱相對于150 mm的色譜柱而言，可以略延長保留時間，增加分離度，但總體無顯著性差異，因此選擇150 mm色譜柱可以提高效率，較適合臨床常規(guī)檢測工作。填料粒徑3.5 μm的色譜柱與5 μm的色譜柱相比，可以增加分離度，改善峰形。但對于生物樣品來說，往往雜質較多，且蛋白沉淀難以完全，易導致色譜柱污染，同時3.5 μm的色譜柱的價格遠遠高于5 μm的色譜柱，大大提高成本。綜合以上特點，本課題組選擇150 mm的填料粒徑5 μm的色譜柱進行實驗，為以后臨床常規(guī)檢測奠定基礎。

本方法在15 min內可以完全出峰，考慮到生物藥品的復雜性，因此本課題組在15 min后加入一段較長時間的沖洗與次針預平衡時間，從而保證次針檢測的穩(wěn)定性與準確性。

通過血藥質量濃度監(jiān)測，可以避免因個體差異導致的血藥質量濃度過高所致的不良反應，同時可以避免血藥質量濃度過低導致的療效降低及耐藥性的產生。

參考文獻：

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