磷霉素鈣口服制劑有關物質測定方法的建立

劉雪峰，樊寶娟，王小亮，曾愛國，常 春，傅 強*(.西安交通大學藥學院，西安 7006；.陜西省食品藥品檢驗所，西安 70065)

磷霉素最早是由西班牙CEPA公司的Hendin等從費氏鏈霉菌發酵液中分離得到的一種廣譜抗生素。本品的抗菌譜較廣，對大多數革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有一定的抗菌作用[1-4]。臨床上主要用于腸道感染、泌尿系統感染、皮膚科及軟組織感染及呼吸道感染等。常用的口服制劑為磷霉素鈣片、磷霉素鈣膠囊和磷霉素鈣顆粒。

《中國藥典》2010年版二部未對磷霉素鈣口服制劑中的雜質進行控制，僅在磷霉素鈣原料中采用滴定方法對磷霉素二醇物進行控制[5]，而對其有關物質的檢查，采用專屬性較強的方法很少見報道。本文建立了HPLC-ELSD方法對磷霉素鈣口服制劑中雜質進行控制，并對磷霉素二醇物進行了LC/MS定性，采用自身對照方法進行定量，所建立的方法專屬性強，準確無干擾，為更好地控制產品質量提供了有效的檢測方法。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Alliance HT型高效液相色譜儀，Attoch 3300蒸發光檢測器，Empower工作軟件；賽多利斯BP211D型電子分析天平，精度為0.01 mg。

1.2試藥 樣品：磷霉素鈣片(不同生產企業提供的樣品共11批)；磷霉素鈣膠囊(不同生產企業提供的樣品共34批)；磷霉素鈣顆粒(不同生產企業提供的樣品共6批)；磷霉素鈣對照品(購自中國食品藥品檢定研究院，批號0351-200001)；甲醇、乙腈為色譜純，購自Merck公司；水為重蒸餾水；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1色譜條件與系統適用性實驗 色譜柱采用Apllo C18(250 mm×4.60 mm，5 μm)；以5 mmol·L-1正辛胺(用醋酸調pH4.8)-乙腈(90∶10)為流動相；流速為0.8 mL·min-1；用蒸發光檢測器檢測(參考條件:漂移管溫度60 ℃；載氣流速為2.0 L·min-1)。理論板數按磷霉素峰計算應不低于2 000。磷霉素主峰與其相鄰的雜質峰分離度應不低于2.0。

2.2系統適用性溶液制備 取磷霉素鈣對照品適量，用5 mmol·L-1正辛胺溶液(用醋酸調pH3.5)制成1 mL約含磷霉素1 mg的溶液，水浴90 ℃加熱10 min，放冷至室溫，精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀中，色譜圖中磷霉素主峰面積與相鄰雜質峰的分離度應不小于2.0。見圖1。

圖1 系統適用性色譜圖

2.3供試品溶液制備 取裝量或質量差異項下的供試品，研細，精密稱取適量，用水制成1 mL約含磷霉素1 mg的溶液，作為供試品溶液。

2.4自身對照溶液制備 取上述磷霉素供試品溶液，加水制成1 mL約含磷霉素25，50和100 μg的溶液，作為對照品溶液(1)，(2)和(3)。

2.5測定方法 精密吸取空白溶液、系統適用性溶液、供試品溶液和對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖，按自身對照外標法以峰面積的對數與質量濃度呈線性關系計算雜質含量。不同劑型檢測結果見圖2。

2.6溶液穩定性實驗 取磷霉素鈣對照品適量，用水制成1 mL約含磷霉素25，50和100 μg的溶液，分別測定其室溫放置0，0.5，1，2，4，8和12 h的主峰峰面積，其RSD分別為1.22%，0.94%和0.91%。說明樣品溶液在12 h內較為穩定。

圖2 不同劑型有關物質色譜圖

3 方法學考察

3.1破壞性實驗

3.1.1水溶液中高溫破壞性實驗 精密稱取磷霉素鈣原料藥適量，加水制成1 mL約含磷霉素1 mg的溶液，作為供試品溶液。將供試品溶液于90 ℃水浴中分別加熱1， 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11和12 h；分別取對照品溶液(1)，(2)和(3)和供試品溶液各時間段破壞的溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，供試品溶液色譜圖中如有降解產物，降解產物峰面積和對照品溶液色譜峰面積按外標法峰面積的對數與質量濃度成正比關系計算含量。結果見表1。

3.1.2強酸溶液中高溫破壞性實驗 精密稱取磷霉素鈣原料藥適量，用5 mmol·L-1正辛胺溶液(用醋酸調pH3.5)制成1 mL約含磷霉素1 mg的溶液，作為供試品溶液。將供試品溶液于90 ℃水浴中分別加熱1， 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11和12 h；分別取對照品溶液(1)，(2)和(3)和供試品溶液各時間段破壞的溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，供試品溶液色譜圖中如有降解產物，降解產物峰面積和對照品溶液色譜峰面積按外標法峰面積的對數與質量濃度成正比關系計算含量。結果見表1。

3.1.3強堿溶液中破壞性實驗 精密稱取磷霉素鈣原料藥適量，用0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液制成1 mL約含磷霉素1 mg的溶液，作為供試品溶液。將供試品溶液于60 ℃水浴中分別加熱1， 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11和12 h；分別取對照品溶液(1)，(2)和(3)和供試品溶液各時間段破壞的溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，供試品溶液色譜圖中如有降解產物，降解產物峰面積和對照品溶液色譜峰面積按外標法峰面積的對數與質量濃度成正比關系計算含量。結果見表1。

3.2檢出限和定量限 將磷霉素鈣對照品水溶液進行適當稀釋后制得一系列不同質量濃度的溶液，進行分析，以S/N=3作為檢測限，S/N=10作為定量限，結果磷霉素鈣檢測限為6.82 ng，定量限為10.23 ng。

3.3線性關系考察 取磷霉素鈣對照品適量，加水制成1 mL約含磷霉素20.2，40.4，60.6，80.8和 121.2 μg的溶液，分別取10 μL，注入高效液相色譜儀中，以質量濃度為橫坐標、色譜峰面積的對數為縱坐標，繪制標準曲線，結果回歸方程：Y=47.686X+0.226 4，r=0.999 2。

3.4加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的磷霉素鈣膠囊、磷霉素鈣片和磷霉素鈣顆粒各9份(約相當于磷霉素7.5 mg)，分別精密加入磷霉素對照品約4.5，7.5和10.5 mg，置于100 mL量瓶中，加水適量超聲溶解并稀釋到刻度，搖勻，制成相對含量分別為80%，100%和120%的溶液各3份，分別取10 μL，注入高效液相色譜儀中，計算回收率，結果磷霉素鈣膠囊平均回收率為98.7%，RSD為0.98%，磷霉素鈣片平均回收率為96.8%，RSD為1.14%，磷霉素鈣顆粒平均回收率為93.6%，RSD為1.65%。

表1 不同時間破壞性實驗結果

3.5精密度實驗 取磷霉素鈣對照品適量，用水制成1 mL約含磷霉素25，50和100 μg的溶液，分別連續進樣6次，測定色譜主峰峰面積，其RSD分別為0.89%，0.57%和0.36%。

3.6專屬性實驗 取磷霉素鈣系統適用性溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，收集主峰相對保留時間0.73處的雜質注入質譜檢測器中[6]，結果其m/z153.9，判斷其結構為磷霉素二醇物。其一階質譜圖見圖3。

圖3 磷霉素鈣系統適用性溶液降解產物一階質譜圖

4 樣品的測定

對全國磷霉素鈣片、磷霉素鈣膠囊以及磷霉素鈣顆粒共計51批次樣品進行了測定，結果均檢出磷霉素二醇物，其中磷霉素鈣片中磷霉素二醇物含量為0.95%～4.25%，磷霉素鈣膠囊中磷霉素二醇物含量為0.45%～1.33%，磷霉素鈣顆粒中磷霉素二醇物含量為1.91%～4.52%。

5 結果與討論

磷霉素鈣的水溶液和pH 3.5的5 mmol·L-1的正辛胺溶液在高溫下都會降解，同時，降解產物的量隨著時間的變化而變化。其中磷霉素鈣的pH 3.5的5 mmol·L-1的正辛胺溶液在高溫破壞下，降解產物的量隨著時間的增長而增大，在4 h內，降解速率較大，之后隨著加熱破壞時間的增長，降解物的量逐漸緩慢增大。

由于不同的蒸發光檢測器其溫度和氣體流速不盡相同，因此應根據不同品牌的蒸發光檢測器進行適當調節，以滿足檢測條件。

本文采用HPLC-ELSD方法所建立的色譜條件，不僅可以測定磷霉素鈣及其口服制劑有關物質的含量，而且對其測定含量具有很好的指導意義。該方法檢測靈敏度高，分析時間短，分離效果好，結果準確可靠，可有效地控制磷霉素鈣及其制劑的質量。

參考文獻：

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