鉤吻素子對大鼠焦慮行為的影響

黃慧慧，劉 銘，陳超杰，俞昌喜(福建醫科大學藥學院，福州 350004)

焦慮癥(anxiety disorders)又名焦慮障礙，或者焦慮精神性疾病，是一類以發作性或持續性情緒焦慮和緊張為主要特征的精神性疾病[1]。焦慮癥的發病率逐年上升，嚴重影響了人們的生活質量。藥物治療是目前應用最廣泛、最有效的治療手段[2]。然而，經典的一線抗焦慮藥在治療焦慮癥的同時，往往具有藥物依賴、鎮靜、性功能障礙等不良反應，使其臨床應用受到限制[3-4]，因此，亟待研發有效安全的新型抗焦慮藥。鉤吻為馬錢科胡蔓藤屬植物，中國鉤吻盛產于閩、桂、浙等地，其主要成分為吲哚類生物堿，含有數十種生物堿單體[5]，其中鉤吻素子(koumine) 為國產鉤吻生物堿單體中含量最高的一種有效成分。本實驗室前期采用小鼠高架十字迷宮實驗和明暗穿梭箱測試方法，首次觀察到鉤吻素子具有顯著的抗焦慮作用[6]。然而，鉤吻素子抗焦慮作用有待于在更多的焦慮動物模型上確證。本文擬在此基礎上，采用單次給藥和連續給藥2種給藥方式，考察鉤吻素子在大鼠高架十字迷宮模型中的抗焦慮作用及其特點。

1 儀器與材料

1.1儀器 大鼠高架十字迷宮在文獻基礎上自制[7]，包括2個50 cm×10 cm的相對開臂、2個50 cm×10 cm×40 cm的相對閉臂和開放臂與封閉臂交叉處為一個10 cm×10 cm的中央平臺，迷宮距離地面50 cm。高架十字迷宮周圍布以1.5 m高黑色單調背景，上方安置一個與電腦相連接的攝像頭，用于記錄大鼠在實驗期內的活動。

1.2試藥 鉤吻素子粉末，由本課題組分離純化，并經高效液相色譜鑒定，質量分數為99.2%，臨用時用生理鹽水配成所需質量濃度的溶液；地西泮注射液，天津金耀氨基酸有限公司，批號1010181，用生理鹽水配成所需質量濃度的溶液，新鮮配制。

1.3動物 清潔級雄性Wistar大鼠，體質量180～200 g，許可證號：SCXK(滬)2012-0002，上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。在光暗周期12/12 h(光照時間8:00～20:00)、恒濕度(50%±5%)、恒溫(24±2 ℃)環境飼養，自由進食和飲水，每2 d換1次墊料，動物室保持安靜。實驗前7 d每天撫摸大鼠1～2 min，減少無關刺激對實驗的影響。給藥前1 h將大鼠移至實驗室，使之熟悉環境，消除陌生環境對大鼠的影響。所有針對大鼠的實驗操作均遵守國際和本地實驗動物使用和保護委員會頒布的條例。

2 方法

2.1動物分組及給藥 大鼠隨機分為對照組(生理鹽水)、地西泮(diazepam， DZP)陽性對照組(0.5 mg·kg-1)及鉤吻素子0.75， 1.5和3 mg·kg-1劑量組，每組7～19只大鼠，按0.005 mL·g-1頸背部皮下單次量注射給藥1 h后，于9:00～13:00進行行為學測試；另取大鼠隨機分為對照組(生理鹽水)、DZP組(0.5 mg·kg-1)及鉤吻素子0.1875， 0.75， 1.5和3 mg·kg-1劑量組，每組7～15例。0.005 mL·g-1，頸背部皮下注射給藥，每天1次，連續7 d(其中DZP組則第1～6 d給予等體積生理鹽水，第7 d給予DZP 0.5 mg·kg-1)，各組于d 7末次給藥1 h后于9:00～13:00進行行為學測試。

2.2行為學測試 將實驗動物迅速置于迷宮的中央開闊部，使其頭部正對其中一個開臂，通過上方的攝像機拍攝5 min內動物的活動情況，記錄下述指標：①封閉臂進入次數(close arm entry，CE)；②開放臂進入次數(open arm entry，OE)；③開放臂停留時間(open arm time，OT)。通過以上行為學指標分別計算下列指標：動物進入開放臂和封閉臂的總次數(total arm entries)；動物進入開放臂次數比例(OE%)，即OE/(CE+OE)×100%；動物在開放臂停留時間比例(OT%：OT/總時間×100%)。

2.3統計學處理 采用SPSS 13.0 for Windows 軟件對實驗數據進行計算。數據用均數±標準誤(mean±S.E.M)表示，兩組間均數比較采用雙側t檢驗，多組數據間采用one-way ANOVA方法進行統計處理，差異有顯著性時再用LSD-post hoc進行統計分析。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1鉤吻素子單次給藥對大鼠在高架十字迷宮中行為的影響 結果見表1。結果顯示：鉤吻素子在1.5和3 mg·kg-1的劑量下，能顯著增加大鼠OE%和OT%值(P<0.01或P<0.05)；鉤吻素子在0.75 mg·kg-1的劑量下，能顯著增加大鼠OT%值(P<0.01)，但對大鼠OE%值無顯著影響。鉤吻素子在以上3個劑量下不影響大鼠的總入臂次數(總入臂次數代表動物的運動活性)，表明鉤吻素子在此模型上有顯著的抗焦慮作用。

表1 鉤吻素子單次皮下注射給藥對大鼠在高架十字迷宮中行為的影響

3.2鉤吻素子連續給藥對大鼠在高架十字迷宮中行為的影響 結果見表2。結果顯示：鉤吻素子在0.75，1.5和3 mg·kg-1劑量下，均能增加大鼠OE%和OT%值(P<0.01或P<0.05)，且不增加動物的總入臂次數，說明鉤吻素子在此模型上有明顯地抗焦慮作用。

表2 鉤吻素子連續皮下注射給藥對大鼠在高架十字迷宮中行為的影響

4 討論

有研究指出，北美鉤吻總生物堿在劑量為150 mg·kg-1時，能顯著性地提高小鼠在高架十字迷宮中進入開放臂的次數和時間[12]。在小鼠明暗穿箱實驗中發現，北美鉤吻總生物堿能顯著提高小鼠在明箱中的停留時間和明暗箱穿梭次數[12-14]，顯示出顯著的抗焦慮作用。鉤吻生物堿單體鉤吻素甲和鉤吻素子在小鼠明暗穿箱模型中，也顯示出顯著的抗焦慮作用[6]。此外，鉤吻素子與其他鉤吻生物堿單體相比，毒性相對較小(小鼠LD50為99.0 mg·kg-1，sc)，初步提示了鉤吻素子可能具有高效、低毒的抗焦慮作用。在此基礎上，本文采用大鼠高架十字迷宮為動物模型，從不同角度進一步探討鉤吻生物堿中鉤吻素子的抗焦慮作用和特點。

文中結果提示，鉤吻素子在大鼠高架十字迷宮模型中呈現出與地西泮一致的抗焦慮作用，作用呈劑量依賴性。有趣的是，我們發現在大鼠高架十字迷宮單次給藥和連續給藥時，鉤吻素子的抗焦慮作用并不是呈經典的線性關系。其原因可能是鉤吻素子在一定范圍內達到了抗焦慮作用的最大效應，其抗焦慮作用不再隨著藥物劑量的增加而增強，所以出現與焦慮相關的腦區對高劑量鉤吻素子反而不敏感。由此可見，在應用鉤吻素子抗焦慮時要嚴格控制其劑量。此外，我們還觀察到鉤吻素子對動物的運動活性并無顯著影響，說明其發揮抗焦慮作用的同時，無鎮靜催眠作用。

綜上所述，鉤吻素子可能有抗焦慮作用，并具有高效、低毒的特征，有望成為治療焦慮癥的新型藥物。鑒于焦慮動物模型的多樣性，其抗焦慮作用還有待于在更多的模型上確證，其抗焦慮作用的機制也有待探究。

參考文獻：

[1] 沈漁村. 精神病學[M]. 4版. 北京: 人民衛生出版社， 2001: 678-679.

[2] Sandford J J， Argyropoulos S V， Nutt D J. The psychobiology of anxiolytic drugs. Part 1: basic neurobiology[J]. Pharmacol Ther， 2000， 88(3): 197-212.

[3] Bandelow B， Zohar J， Hollander E， et al. World Federation of Societies of Biological Psychiatry (WFSBP)

guidelines for the pharmacological treatment of anxiety， obsessive-compulsive and post-traumatic stress disorders-first revision[C]. World J Biol Psychiat， 2008， 9(4): 248-312.

[4] 支媗， 高粉霞. 帕羅西汀治療抑郁癥的療效觀察[J]. 西北藥學雜志， 2006， 21(5): 226-227.

[5] Xu Y K， Yang S P， Liao S G， et al. Alkaloids fromGelsemiumelegans[J]. J Nat Prod， 2006， 69(9): 1347-1350.

[6] Liu Ming， Huang Hui-Hui， Yang Jian， et al. The active alkaloids ofGelsemiumelegansBenth. are potent anxiolytics[J]. Psychopharmacology， 2013， 225(4): 839-851.

[7] 張均田. 神經藥理學研究技術與方法[M]. 北京: 人民衛生出版社， 2005: 352-353.

[8] Ramos A. Animal models of anxiety: do I need multiple tests?[J]. Trends Pharmacol Sci， 29(10): 493-498.

[9] Wahlsten D， Metten P， Phillips T J， et al. Different data from different labs: lessons from studies of gene-environment interaction[J]. J Neurobiol， 2003， 54(1): 283-311.

[10]Jones N， King S M. Influence of circadian phase and test illumination on pre-clinical models of anxiety[J]. Physiol Behav， 2001， 72(1/2): 99-106.

[11]Walf A A， Frye C A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents[J]. Nat Protoc， 2007， 2(2): 322-328.

[12]Dutt V， Dhar V J， Sharma A. Antianxiety activity ofGelsemiumsempervirens[J]. Pharm Biol， 2010， 48(10): 1091-1096.

[13]Bellavite P， Magnani P， Zanolin E， et al. Homeopathic doses ofGelsemiumsempervirensimprove the behavior of mice in response to novel environments[J]. Evid Based Complement Alternat Med， 2011:362517.

[14]Magnani P， Conforti A， Zanolin E， et al. Dose-effect study ofGelsemiumsempervirensin high dilutions on anxiety-related responses in mice[J]. Psychopharmacology， 2010， 210(4): 533-545.