驅(qū)白艾力勒思亞散乙醇提取物對小鼠B16黑素瘤細胞增殖及黑素生成的影響

竇 勤，閆 明，彭曉明，斯拉甫·艾白，李建梅*( 1.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，烏魯木齊 830049；2.新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實驗室，烏魯木齊 830049)

白癜風(fēng)是一種臨床上常見的獲得性的色素脫失性皮膚病，發(fā)病率約為4%，病因尚不清楚，雖然白癜風(fēng)的治療藥物很多，但有效而不良反應(yīng)少的藥物仍然較少[1]。在維吾爾醫(yī)治療白癜風(fēng)的諸多方劑中，本文遴選出具有代表性的復(fù)方制劑驅(qū)白艾力勒思亞散，通過酶學(xué)細胞實驗篩選對小鼠B16細胞增殖、酪氨酸酶活性以及黑素生成的影響。酪氨酸酶活性是研究色素障礙性疾病的靶點[2-3]，維吾爾醫(yī)對白癜風(fēng)的治療積累了不少成功經(jīng)驗，本實驗采用小鼠B16黑素瘤細胞為模型，研究驅(qū)白艾力勒思亞散乙醇提取物對小鼠B16細胞的細胞增殖活性、酪氨酸酶活性以及黑素生成量的影響，探討其治療白癜風(fēng)的作用機制。

1 儀器與材料

1.1儀器 倒置顯微鏡(LaiKa公司)；自動酶標儀(MODEL550 BIO-RAD)。

1.2試藥 胎牛血清和RPMI1640培養(yǎng)基，均由美國Gibco公司提供；二甲基亞砜(DMSO)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、 L-多巴、四甲基偶氮唑藍 (MTT)，購自美國Sigma公司；1640培養(yǎng)基(含2種抗生素：100 μg·mL-1鏈霉素、100 U·mL-1青霉素)。驅(qū)白艾力勒思亞散由新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所自制；選擇甲氧沙林(8-MOP)作為陽性對照藥，該藥由重慶華邦制藥股份有限公司生產(chǎn)，實驗時用二甲基亞砜溶解成低、中、高(10，50，100 μmol·L-1)3個濃度。

1.3細胞株 中國科學(xué)院上海細胞研究所提供(小鼠B16黑素瘤細胞株)。

2 方法

2.1乙醇提取物的制備 取適量驅(qū)白艾力勒思亞散在烘箱中適溫焙干后，粉碎過篩，稱取過篩后的粉末10 g，置于容器內(nèi)，加入100 mL體積分數(shù)90%乙醇溶液，密封，均勻浸泡。2周后將濾液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成稠膏至干，稱質(zhì)量后用二甲基亞砜溶液溶解成10 mg·mL-1的溶液。1640培養(yǎng)基稀釋后處理細胞，二甲基亞砜體積分數(shù)低于0.2%[3]。

2.2小鼠B16黑素瘤細胞培養(yǎng) 1640培養(yǎng)基(含體積分數(shù)10%小牛血清)在37 ℃、體積分數(shù)5%CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細胞生長至融合狀態(tài)時，用胰蛋白酶(體積分數(shù)0.25%)消化，每3天傳代1次[4]，每瓶約105個細胞傳代至25 cm2。

2.3細胞增殖活性測定(四甲基偶氮唑藍法)

2.3.1細胞接種 取對數(shù)生長期細胞常規(guī)消化，取100 μL調(diào)整好的細胞液(5×104個·mL-1)，接種于96孔板，37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)24 h，每孔加100 μL稀釋好的中藥復(fù)方，使藥物的質(zhì)量濃度為低、中、高(2，10，20 μg·mL-1)3個質(zhì)量濃度，每個質(zhì)量濃度設(shè)立3個復(fù)孔。

2.3.2細胞增殖活性測定 設(shè)單純培養(yǎng)基組、中藥對照組(培養(yǎng)基+中藥組)和空白對照組(培養(yǎng)基+細胞組) 為對照組，置于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2孵箱中作用72 h，每孔加5 mg·mL-1四甲基偶氮唑藍溶液20 μL，在37 ℃、體積分數(shù)5%CO2孵箱中作用4 h，棄上清，每孔加二甲基亞砜溶液100 μL，其吸光度值用酶標儀測定，用所測的吸光度值表示細胞增殖活性。

2.4黑素含量測定(氫氧化鈉裂解法) 細胞接種方法與對照設(shè)置同上所述，藥物作用72 h，棄上清液，用磷酸鹽緩沖液沖洗2次，加入氫氧化鈉(100 μmol·L-1)，水浴1 h(37 ℃)，其吸光度值在酶標儀460 nm波長處測定，用所測的吸光度值表示黑素生成量。

2.5酪氨酸酶活性的測定 細胞接種方法與對照設(shè)置同上所述，藥物作用72 h，棄上清液，用磷酸鹽緩沖液沖洗2次，每孔加入100 μL體積分數(shù)1%聚乙二醇辛基苯基醚，震蕩5 min，置于-20 ℃1 h，隨室溫融化，使細胞完全裂解，每孔加入100 μL用磷酸鹽緩沖液配制的L-多巴液(體積分數(shù)0.1%)，37 ℃孵育2 h，其吸光度值在酶標儀460 nm波長處測定，用所測吸光度值表示酪氨酸酶的活性。

3 結(jié)果

3.1小鼠B16黑素瘤細胞增殖活性測定 細胞增殖活性=實驗組的吸光度值-中藥對照組的吸光度值，空白對照組細胞增殖活性=空白對照組的吸光度值-單純培養(yǎng)基對照組的吸光度值[5-6]。

驅(qū)白艾力勒思亞散乙醇提取物在中質(zhì)量濃度(10 μg·mL-1)有明顯促進細胞增殖作用(P<0.05)，高質(zhì)量濃度(20 μg·mL-1)有顯著促進細胞增殖作用(P<0.01)，8-MOP在中、高2個濃度(50和100 μmol·L-1)下對B16細胞增殖有顯著的促進作用(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 復(fù)方乙醇提取物對小鼠B16黑素瘤細胞增殖活性的影響

3.2黑素生成含量測定 黑素生成量=實驗組的吸光度值-中藥對照組的吸光度值，空白對照組黑素生成量=空白對照組的吸光度值-單純培養(yǎng)基對照組的吸光度值[7]。

驅(qū)白艾力勒思亞散乙醇提取物在低、中質(zhì)量濃度(5和10 μg·mL-1)有明顯促進細胞黑素生成作用(P<0.05)， 高質(zhì)量濃度(20 μg·mL-1)有顯著促進細胞黑素生成作用(P<0.01)，8-MOP在低、中濃度(10和50 μmol·L-1)有明顯促進細胞黑素生成作用(P<0.05)， 高質(zhì)量濃度(100 μmol·L-1)有顯著促進細胞黑素生成作用(P<0.01)。結(jié)果見表2。

表2 復(fù)方乙醇提取物對小鼠B16黑素瘤細胞黑素生成量的影響

3.3酪氨酸酶活性測定 酪氨酸酶活性=實驗組的吸光度值-中藥對照組的吸光度值，空白對照組酪氨酸酶活性=空白對照組的吸光度值-單純培養(yǎng)基對照組的吸光度值[8]。

驅(qū)白艾力勒思亞散乙醇提取物在中質(zhì)量濃度(10 μg·mL-1)有明顯促進細胞黑素合成作用(P<0.05)，高質(zhì)量濃度(20 μg·mL-1)有顯著促進細胞黑素合成作用(P<0.01)，8-MOP在中、高濃度(50和100 μmol·L-1)有明顯促進細胞黑素合成作用(P<0.05)。見表3。

表3 復(fù)方乙醇提取物對小鼠B16黑素瘤細胞酪氨酸酶活性的影響

4 討論

驅(qū)白艾力勒思亞散是由維藥西青果、余甘子、訶子肉、黑種草子、巴旦仁組成的復(fù)方制劑，是維吾爾醫(yī)治療白癜風(fēng)的經(jīng)典劑型[9]。

本實驗采用一般中藥實驗研究常用的醇提方法，研究驅(qū)白艾力勒思亞散對細胞的酪氨酸酶、小鼠B16黑素瘤細胞的增殖、黑素生成的影響，酪氨酸酶是黑素合成的關(guān)鍵限速酶[10-11]，以酪氨酸酶的活性為靶點是研究白癜風(fēng)等色素障礙性疾病病因病理的關(guān)注點[12]。本實驗結(jié)果顯示，驅(qū)白艾力勒思亞散乙醇提取物對小鼠B16黑素瘤細胞的增殖有明顯促進作用，對黑素合成有顯著促進作用，對細胞的酪氨酸酶活性有顯著的促進作用，其中高濃度作用明顯，且各指標的一致性較好，通過本實驗發(fā)現(xiàn)，8-MOP對B16有一定激活作用。維吾爾醫(yī)治療白癜風(fēng)已積累了豐富的經(jīng)驗， 但其確切作用機制至今仍不清楚，本實驗為治療白癜風(fēng)等色素障礙性疾病藥物的細胞篩選奠定了實驗基礎(chǔ)。

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