鹽酸頭孢吡肟在小鼠肺內的藥代動力學研究

侯文潔，張 亮，李梓源，丁紅梓，周秋云*(.南京市胸科醫院藥學部，南京 009；.南京醫科大學藥學院，南京 66)

頭孢吡肟 (cefepime) 為第四代廣譜頭孢菌素，具有較強的抗革蘭陽性菌和革蘭陰性菌作用[1-2]。目前，頭孢吡肟在敏感菌所致的下呼吸道感染治療中應用廣泛[3-4]。因此，探索頭孢吡肟在肺組織中的藥動學特性，對指導臨床合理使用有一定的意義。本實驗結合已有的文獻報道，摸索并建立了簡單的方法來測定頭孢吡肟在肺組織中的濃度。研究小鼠進行單次尾靜脈注射后肺內頭孢吡肟的藥動學特性，為臨床上其治療下呼吸道感染提供實驗基礎，為進一步開展頭孢吡肟的藥動學和生物利用度研究提供依據。

1 儀器與材料

1.1儀器 島津 LC-20AB高效液相色譜儀(檢測器為SPD-M20A，日本島津公司)；組織勻漿機(Bioprap-24.杭州奧盛)；高速離心機(TG1650-ws，上海盧湘儀)；全自動渦旋儀(MX-S，大龍興利)。

1.2試藥 頭孢吡肟對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：130524-200502，質量分數大于83.0%)；茶堿對照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號：100121-201104，質量分數大于98.0% )；鹽酸頭孢吡肟(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號：3H00316，規格：1.0 g)；甲醇、乙腈、三氯乙酸(色譜純，美國TEDIA公司)；其他試劑為分析純(南京化學試劑有限公司)。

1.3動物 ICR小鼠，18～22 g(SPF級，雌雄各半，動物生產許可證號：SCXK(滬)2008-0016，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司)。

2 方法與結果

2.1色譜條件 色譜柱：Waters Xselect-HSS T3(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-20 mmol·L-1醋酸銨溶液(冰醋酸調pH至5)=9∶11；流速：1 mL·min-1；柱溫：40 ℃；檢測波長：254 nm；進樣量：20 μL。

2.2溶液的配制

2.2.1對照品溶液的配制 精密稱取頭孢吡肟對照品，置于10 mL量瓶中，用超純水溶解定容后配成1.0 mg·mL-1的對照品儲備液，4 ℃冰箱保存備用。

2.2.2內標溶液的配制 精密稱取茶堿對照品，用甲醇溶解后稀釋成0.1 mg·mL-1的溶液，備用。

2.3給藥方案與樣品采集 ICR小鼠，78只，隨機分為13 組，每組禁食 12 h后，靜脈注射給藥1 000 mg·kg-1。分別于給藥后 0.08，0.16，0.30，0.45，0.60，0.85，1.17，1.5，2，3，4，6和8 h取肺組織，-20 ℃冰箱保存。

2.4樣品處理 取空白小鼠肺臟，吸水紙吸干后用剪刀剪碎，分析天平稱質量，加3倍量的生理鹽水并用勻漿器制成均質的肺組織勻漿液。取300 μL加入1.5 mL離心管中，再加入質量濃度為0.1 mg·mL-1的內標茶堿溶液20 μL，加入0.1 mg·mL-1的三氯乙酸溶液150 μL，渦旋2 min，以16 000 r · min-1離心5 min，取上清液經0.45 μm濾膜過濾。

2.5方法學考察

2.5.1方法專屬性 取6只ICR小鼠( 雌雄各半) 的空白肺組織勻漿液各2份，每份300 μL，1份置于2.5 mL離心管中，不加內標，按2.4項下方法操作，進樣20 μL獲得空白色譜圖(圖1A)；另1份空白肺組織中加入一定質量濃度的頭孢吡肟標準溶液及內標茶堿溶液，同法操作后獲得相應的色譜圖(圖1B)，頭孢吡肟對照品及內標的保留時間分別為6.4和8.7 min； 取給藥后的小鼠10 min時間段的肺組織樣品，同法操作后獲得相應的色譜圖(圖1C) 。結果表明，本實驗條件下的頭孢吡肟和內標物分離良好，肺組織中內源性雜質對樣品測定不產生干擾。

圖1 鹽酸頭孢吡肟肺組織樣品HPLC圖

2.5.2線性范圍和定量限 精密量取300 μL空白肺組織勻漿液，加入一定量的對照品儲備液及質量濃度為0.1 mg·mL-1的內標茶堿溶液20 μL，渦旋混勻后，配制成頭孢吡肟肺組織勻漿液，標準模擬肺組織勻漿液工作曲線，質量濃度分別為0.1，0.2，1，2，10和20 μg· mL-1。按2.4項下進行處理，進樣20 μL，HPLC分析。以肺組織中頭孢吡肟質量濃度為橫坐標、頭孢吡肟及內標峰面積比值為縱坐標，用最小二乘法回歸運算，得到直線回歸方程：

Y=0.175 9X+0.021 6(r=0.999 2)

結果表明，在 0.1～20 μg·mL-1范圍內，線性關系良好。

取肺組織終質量濃度為0.1 μg·mL-1的質控樣品5份，按2.4項下進行測定，結果平均值為0.085 μg·mL-1，標準差為0.004，RSD為4.167%，定量下限為0.1 μg·mL-1，滿足方法學樣品的測定要求。

2.5.3精密度 精密量取300 μL空白肺組織勻漿液，加入一定量的對照品儲備液，加入質量濃度為0.1 mg·mL-1內標茶堿溶液20 μL，渦旋混勻后，配制成低、中、高質量濃度質控樣本，頭孢吡肟肺組織質量濃度分別為0.2，2和20 μg·mL-1。按2.4項下進行處理，進樣量20 μL。每個質量濃度分別測5份樣品，連續測3 d，考察日內及日間精密度，其RSD為2.05%～13.18%。

2.5.4回收率 精密量取300 μL空白肺組織勻漿液，加入一定量的對照品儲備液，加入質量濃度為0.1 mg·mL-1內標茶堿溶液20 μL，渦旋混勻后，配制成低、中、高質量濃度質控樣本，頭孢吡肟肺組織質量濃度分別為0.2，2和20 μg·mL-1，按2.4項下進行處理，每個質量濃度測5次，進樣量20 μL。求出頭孢吡肟與內標的峰面積比，代入標準曲線，計算頭孢吡肟的質量濃度以及方法回收率。該方法回收率分別為95.22%，98.74%和100.32%，RSD分別為5.76%，5.32%，4.28%。以標準肺組織樣品中提取后測得的峰面積與對應質量濃度對照品溶液所測得的峰面積之比計算提取回收率，其值分別為80.29%，83.97%和86.21%，RSD分別為8.76%，5.48%，2.94%。

2.5.5穩定性 配制頭孢吡肟在肺組織勻漿液中高、中、低質量濃度質控樣品，質量濃度分別為0.2，2和20 μg·mL-1。考察其在室溫放置24 h后的穩定性。其值穩定，RSD為3.73%～11.87%；樣品在-20 ℃冰箱中保存3 d穩定，RSD為1.18%～11.45%；樣品反復凍融解凍2次后穩定，RSD為1.68%～13.14%。

2.5.6小鼠肺內藥動學 按2.3項下處理并測定各個時間點小鼠肺組織中的藥物濃度(表1)，得鹽酸頭孢吡肟在肺組織中藥時曲線圖(圖2)。用DAS3.1藥代動力學軟件對肺組織藥物濃度-時間數據進行處理，鹽酸頭孢吡肟的肺內藥動學符合一室模型，以統計矩方法求得相應的藥動學參數(表2)。

表1 各個時間點小鼠肺組織中的藥物濃度

圖2 鹽酸頭孢吡肟肺組織中藥物濃度-時間曲線

表2 鹽酸頭孢吡肟在肺中的藥動學參數

3 討論

本實驗在建立色譜條件時，參考了已有文獻[5-6]，對流動相磷酸鹽和醋酸銨進行了系統適用性比較，兩者的色譜行為相差不大，最終選擇了對色譜柱損害相對較小的醋酸銨。本實驗在選擇沉淀劑時，比較了體積分數30%，20%和10%三氯乙酸，通過色譜圖發現體積分數30%和20%三氯乙酸的雜質峰多于體積分數10%三氯乙酸，推測可能是體積分數較高的三氯乙酸本身有可能會引入雜質。體積分數10%的三氯乙酸已經可以沉淀完全。準確進行生物樣品含量測定時，選擇合適的內標最為關鍵。在類似研究中，有文獻報道以茶堿、對乙酰氨基酚、頭孢他啶、阿司匹林等作為生物樣品檢測的內標[5-7]，其中茶堿的色譜行為與頭孢吡肟最為相近且不干擾其測定，因此本實驗選用茶堿作為內標。

研究表明，在常規給藥劑量范圍內，頭孢吡肟在人體內的代謝符合線性動力學的過程，未見藥物在體內有明顯蓄積的現象[8]。本實驗結果表明，頭孢吡肟在小鼠肺內的藥動學符合一室模型，藥物能夠快速進入肺組織，肺內半衰期較短，臨床上可以通過增加給藥頻次或持續外周靜脈給藥以期達到更好的療效。

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