活體示蹤干細胞治療心肌梗死的分子影像技術進展

覃杰 單鴻

近年來使用干細胞移植治療心肌梗死已取得可喜的成績，但對干細胞移植治療后干細胞的分布、歸巢及分化等所知甚少[1-2]。若不能進一步了解移植后干細胞的分布、歸巢及分化，將不能揭示干細胞治療心肌梗死的機制，阻礙干細胞移植治療在臨床的應用。了解干細胞分布、歸巢及分化的最好方法是通過分子影像技術活體示蹤干細胞[2]。隨著科學技術的不斷發展，分子影像技術也得到了不斷發展。活體示蹤干細胞的分子影像技術已成為干細胞移植治療的研究熱點。本文將詳細介紹示蹤干細胞治療心肌梗死的多種分子影像技術的最新進展，探討其優缺點以及臨床適用性。

一、示蹤干細胞的分子影像技術

活體示蹤移植干細胞分布及分化將有助于干細胞移植治療心肌梗死的實驗及臨床研究的發展。示蹤干細胞的分子影像技術有MRI、放射性核素成像、報告基因成像、光學成像以及高效有機整合幾種成像技術為一體的多模態成像。

1.MRI

MRI是通過使用順磁性對比劑來評價心臟結構和功能的最好技術[3]。MRI具有良好的空間 [10～100 μm(小動物磁共振)，500～1 500 μm(臨床)]和時間分辨率，可示蹤標記超順磁和順磁性對比劑的干細胞[3]。磁共振光譜成像(如19F MRI)亦可示蹤移植心肌的干細胞[4]。

1.1超順磁性氧化鐵納米顆粒

Arbab等[6]報道SPIO不影響細胞的活力、增殖、分化和遷移。然而,Schafer等[7]卻發現SPIO會減少間充質干細胞移植和增殖能力以及干擾細胞功能等問題。SPIO可存在標記的干細胞內,亦可存在吞噬死亡干細胞的單核細胞內，因此無法根據MRI低信號來判斷SPIO位于干細胞內還是單核細胞內[8]。此外,SPIO引起的低信號亦無法與含鐵血黃素等血液衍生物引起的低信號相鑒別[9]。Winter等[10]報道MRI不能區別心肌內存活的干細胞及被巨噬細胞吞噬的死亡的干細胞。同樣, Terrovitis等[11]認為MRI高估了SPIO標記的移植心臟的干細胞的存活情況。

1.2順磁離子

釓(Gd)螯合物和錳(Mn)氯化合物等陽性對比劑標記的細胞在T1上表現為低信號。相對于SPIO，MRI對Gd標記的細胞的敏感度較低，因為Gd降低細胞內易與離子螯合的水濃度而降低弛豫效能[12]。此外,在溶酶體和內涵體內低pH的環境下，釓螯合物可能迅速去螯合而游離出可引起生物安全問題的Gd3+離子[12]。

氯化錳(MnCl2)和SPIO一樣可標記和示蹤干細胞，并有望提高MRI活體示蹤干細胞的敏感性[13-14]。Yamada等[13]指出MRI可示蹤亞毫摩爾濃度MnCl2標記的干細胞及活體評價MnCl2標記的干細胞活性。已有新型納米對比劑如碳釓納米管(Gadonanotubes)用于示蹤干細胞,其降低T1弛豫效能好于目前已知的對比劑(為Gd對比劑40倍)[15]。若這些納米對比劑被證實無毒，其定會在將來的分子影像中發揮重要作用。

1.319F MRI

雖然19F MRI尚未廣泛應用于臨床,但19F的一些特性可使19F MRI成為示蹤干細胞治療心肌梗死的較好方法之一；由于正常生物體內不含有19F，故19F MRI信號均來自外源對比劑,如全氟化碳粒子或氟化核苷；由于19F和1H旋比率僅差6%，故19F MRI可使用現有的1H MRI成像硬件[16]。

除了能像1H高選擇性、高分辨率示蹤移植干細胞外，19F還可定量檢測細胞。Partlow等[17]已證實19F MRI能特異性識別、定位和定量干細胞。雖然19F示蹤細胞已成為研究熱點,但其仍處于發展的初期階段，具有敏感度低、成像時間長的缺點。Srinivas等[16]試圖通過完善成像硬件、成像序列及標記方法等來克服19F MRI的缺點，使其在示蹤干細胞中發揮越來越重要的作用。

2.放射性核素成像

放射性核素成像包括正電子發射計算機斷層顯像(PET)及單光子發射計算機斷層成像術(SPECT)。放射性核素成像具有靈敏度高(10-10～10-12mol/L vs 10-3～10-5mol/L MRI)及定量測量干細胞的優點，但也有一些缺點[18]：①空間分辨率(1～2 mm)低于MRI[18]。②僅適用于短期示蹤干細胞，因為用于標記干細胞的放射性物質的半衰期較短[如：18F:110 min；111In(銦):2.8天；99 mTc(锝):6 h][19]。③核素的輻射會減弱細胞活力及增殖。如111In可發射引起生物副反應的Auger 電子。Brenner等[20]報道在移植干細胞術后48 h內盡管干細胞能進入梗死區域，但111In標記的干細胞的活性、增殖及分化明顯受到抑制。Nowak等[21]報道小鼠造血祖細胞即使暴露于較低水平的放射性物質亦受到損害。

PET比SPECT具有更高的靈敏度(2到3個數量級)和更好的空間和時間分辨率。18F脫氧葡萄糖(18F-FDG)已用于標記細胞以及動物實驗和臨床研究的短期示蹤干細胞。不管經過冠狀動脈注射何種類型的干細胞及數量多少的干細胞，PET觀察到的移植效果都不理想，在所有經過靜脈注射干細胞的實驗中，PET均沒能在心肌內檢測到標記的細胞[22-23]。

PET-CT具有更高的靈敏性,可非侵襲性顯示冠狀動脈解剖結構及示蹤干細胞。這種多模態成像可解決18F短半衰期問題。Lang等[24]建議使用半衰期更長的同位素,如64Cu(12.7 h)。

3.報告基因成像

報告基因是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因。報告基因成像將報告基因與探針(光學、核素、磁共振)結合在一起,通過探針顯像報告基因產物的活性水平從而間接提供報告基因表達水平及驅動報告基因表達的內源性信號或轉錄因子水平的信息[25]。報告基因成像具有特異性識別存活細胞(包含基因產物)和中長期示蹤干細胞(解決了探針隨細胞增殖而被稀釋的問題)的優點[25-26]。

報告基因成像已廣泛應用于動物實驗研究中。單純皰疹病毒1型胸苷激酶 (HSV1-tk)及其突變體(HSV1-sr39tk)是目前使用最廣泛的放射性核素成像示蹤報告基因[25-26]。單純皰疹病毒的tk與哺乳動物的不同,其通過高效磷酸化嘌呤及嘧啶核苷酸捕獲配體。常用的HSV1-tk底物有：尿嘧啶核苷衍生物，如FIAU和FEAU；無環鳥苷類衍生物，如18F-羥甲基丁基鳥嘌呤(FHBG)和18F-羥丙基甲基鳥嘌呤(FHPG)。HSV1-sr39tk能更有效地利用無環鳥苷衍生物，標記探針的Vmax/Km值更高，成像效果更佳。因此，HSV1-sr39tk-18F-FHBG是目前最有效的PET報告基因。

Wu等[27]首先使用報告基因成像示蹤移植心臟的干細胞。他們用18F-FHBG PET或生物發光成像(BLI)活體示蹤治療心肌梗死的干細胞(表達HSV1-sr39tk或熒光素酶)2周[27]。此外,Cao等[28]報道使用PET、BLI和熒光成像的三融合報告基因可觀察小鼠胚胎干細胞(ESC)的生存和增殖。

雖然HSV-tk基因成像敏感性高，但由于免疫原性可能會限制其應用于人類。 Ponomarev等[29]提出使用人類線粒體胸苷激酶2型(hTK2)可克服免疫原性的問題。此外，人鈉/碘同向轉運體(hNIS)與124I 或99mTc合用可分別作為PET或SPECT報告基因[13,25]。 由于hNIS可在除心臟以外的器官(如甲狀腺、胃、唾腺和脈絡叢等)表達，因此hNIS無免疫原性，hNIS成像不需要合成復雜的探針[13,25]。

β-半乳糖苷酶、轉鐵蛋白受體、鐵蛋白及高賴氨酸蛋白等均可作為MRI報告基因[30]。Naumova等[31]用MRI示蹤表達鐵蛋白的成肌細胞，但信號衰減高達25%，第3周后MRI已無法檢測到信號。因此，目前活體MRI基因成像尚無法長期示蹤干細胞。

報告基因成像示蹤干細胞治療心肌梗死尚存一些問題[32-33]。首先,報告基因表達的蛋白質可能會影響干細胞的一些細胞功能和治療效果。其次,報告基因與宿主細胞染色質融合是否會導致基因突變而存在致瘤風險，仍存在爭議。

4.光學成像

4.1BLI

BLI是熒光素酶基因標記的細胞或DNA在ATP及氧氣存在的條件下表達熒光素酶, 熒光素酶氧化探針(D熒光素)發光,從而能夠直接檢測活體內的細胞活動和基因行為[27]。BLI已廣泛應用于示蹤干細胞移植治療的動物實驗研究[27-28]。BLI的優點是無創、靈敏度高、可定量分析、操作簡單等，缺點是信號較弱、檢測時間較長、實驗設備成本高及細胞或基因需要轉基因標記等[18,27]。

4.2熒光成像

熒光成像是通過激發光激發熒光報告基團(GFP、RFP, Cyt及dyes等)到達高能量狀態后發光而成像[34]。近紅外成像的出現促進了活體及離體監測干細胞的發展[27,34]。近紅外成像通過減少光吸收和組織散射來增強信號穿透能力，因此其可斷層成像。目前近紅外成像限用于表淺器官成像及示蹤干細胞的動物實驗研究，將來其有可能應用于臨床。Ly等[34]已成功在豬心肌梗死模型中示蹤近紅外染料IR-786標記的MSC，靈敏度可達10 000細胞。量子點是一種無機的熒光納米粒子,已成功用于標記干細胞[35]。MSC的體外培養實驗已證明量子點具有較低生物相容性，不影響細胞活性、增殖或分化[35-36]。量子點可標記干細胞分化過程中的多個轉錄因子，因此量子點有助于系統、深入地研究MSC的分化機制及調控干細胞的分化。Muller-Borer等[35]利用磁性/熒光量子點雙功能納米粒子成功標記大鼠干細胞,標記效率達90%以上。量子點對干細胞功能的長期影響尚不為人知,應關注其金屬芯[鉛、鎘(Cd)和硒(Se)等]的暴露或溶解可能會導致的中毒[37]。

5.多模態成像

多模態成像是將敏感度高的光學成像和放射性核素成像以及解剖分辨率高的MRI等分子影像技術高效地整合成一體的成像技術。越來越多動物實驗已應用多模態成像技術，并取得較好成績。Qiao等[38]將已傳染HSV1-sr39tk及標記SPIO的小鼠ESC注入健康或梗死心肌4周后，通過多模態成像可評估移植細胞的生存和增殖。Qiao等[38]發現ESC的存活及增殖在PET表現為18F-FHBG攝取增加，在MRI上由于SPIO被稀釋表現為低信號區縮小，4周后多數SPIO存在于局部浸潤的巨噬細胞內而非ESC內。動物實驗顯示ESC移植能略改善左心功能，但改善心功能的機制是旁分泌作用而非心肌細胞的增多,因為只有少于0.5%的ESC分化為心肌細胞[38-39]。Higuchi等[40]用已傳染hNIS報告基因及標記SPIO的人臍帶血內皮祖細胞移植治療心肌梗死3天后，PET未能檢測到124I，但MRI低信號可持續存在，說明移植細胞在短期內大量死亡，巨噬細胞吞噬死亡的SPIO標記的移植細胞。多模態成像的研究熱點及重點是如何更有效地有機整合各種分子影像技術，使其在未來活體示蹤干細胞的動物實驗及臨床研究中發揮重要的作用。

二、總 結

雖然已有不少較好的示蹤干細胞的分子影像技術在動物實驗中應用,但仍需不斷完善才能應用于臨床。除了具有爭議的安全和倫理問題外,尚有以下懸而未決的關鍵問題：“最好的移植路徑是什么?”“用何種細胞和用多少細胞移植?”及“何時移植?”。

顯然,目前無單一的最佳分子影像技術示蹤干細胞，因此最好能將具有靈敏度高(光學成像)、空間分辨率高(MRI)和功能成像(PET)的各種分子影像技術高效有機地整合為一體，構建多模態成像。未來分子影像技術應具有更高敏感度及特異度，更少免疫原性和致瘤性，以及更好藥代動力學特性。

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