明視野顯微鏡下特異性區分斑馬魚視網膜細胞核的方法

付金玲，宋 丹，左 玲，鄒 賀，康治臣

(吉林大學第二醫院 1.眼科；2. 康復科，吉林 長春130041)

精確地計數視網膜細胞在時間和空間上的分布是研究視網膜發育及退變的基礎。每個視網膜細胞只有一個細胞核，因此最直接計數視網膜細胞的方法是在光學顯微鏡下計數細胞核的數目。然而，由于視網膜的高核密度使直接核計數非常困難。這主要是源于光學顯微鏡垂直分辨率比水平分辨率低[1，2]。在明視野顯微鏡下精確地計數特定視網膜區域細胞分布情況的前提是能夠特異并敏感地染色薄組織切片細胞核。

上述需要可以通過整合JB-4塑膠樹脂包埋及福爾根反應所完成。JB-4包埋基于乙二醇甲基丙烯酸酯聚合反應[3-7]。因為聚合發生在單體的試劑滲透入生物樣本之后，因此JB-4包埋能夠很好地保持樣本形態。而且JB-4包埋后的組織非常堅硬，最薄可以得到0.5 μm的組織切片[8]。

目前主要使用四個基本類型的染料和試劑染色細胞核，它們分別是基于靜電結合、水解反應、共價修飾以及免疫反應的原理[9]。由Feulgen和Rossenbeck[10]發明的福爾根核染色方法，是基于Schiff試劑和醛基之間的一個共價反應。

本文主要內容是結合JB-4塑膠樹脂包埋和福爾根染色的方法來觀察斑馬魚視網膜細胞核。通過分析JB-4切片厚度、鹽酸水解程度及Schiff反應條件對細胞核染色的影響，尋找一個最佳能夠敏感且特異染色斑馬魚視網膜細胞核的方法。

1 材料與方法

1.1 斑馬魚飼養

AB和TU野生型斑馬魚在14 h光照/10 h黑暗交替循環的恒溫魚房培育飼養。

1.2 方法

1.2.1 眼球固定、JB-4包埋及切片 在常溫下過夜固定野生型斑馬魚成魚眼球，JB-4包埋(Polysciences公司)，仔細觀察并不斷調整組織以達到正確的包埋方向，為判定不同切片厚度對細胞核觀察的影響，將JB-4包埋的組織用超薄切片機(Thermo Electron公司)切片，每個組織切片厚度分別為2 μm、3 μm、4 μm及6 μm。

1.2.2 福爾根染色 為找到最佳的鹽酸水解條件(濃度和時間)、Schiff反應時間及洗滌耐受時間，分別進行如下實驗：

①在常溫下將JB-4切片分別浸泡于裝有1N、2N、3N、4N及5N鹽酸的科普林氏玻片染色缸中，浸泡持續時間從30 min到過夜。將染色后的切片浸泡于蒸餾水中洗滌10 min去除剩余未水解的鹽酸。在常溫下將切片浸泡于Schiff試劑(Santa Cruz公司)中2 h。②將經過3N鹽酸過夜處理的切片浸泡于Schiff試劑中30 min到5 h。③將經過3N鹽酸過夜處理、Schiff試劑浸泡2 h的染色切片用流水沖洗30 s，再分別浸泡于蒸餾水中洗滌5 min、30 min及過夜。④將洗滌過的切片常溫空氣中干燥，蓋玻片下中性樹膠封片。

1.2.3 亞甲天藍II和核固紅染色 ①將2 μm厚的JB-4切片分別在常溫下浸泡于亞甲天藍II(Sigma-Aldrich公司)和核固紅(Trevigen公司)溶液中30 min。②為去除過量的染料，染色后的切片于常溫下用流水沖洗30 s并置于蒸餾水中分別脫染5 min、30 min及過夜。③洗滌過的切片常溫空氣中干燥，蓋玻片下中性樹膠封片。

1.2.4 明視野顯微鏡 使用奧林巴斯BX60顯微鏡PlanApo 60×/1,40和UplanApo 20×/0,80油鏡觀察結果，所有圖像均在同一暴露時間下用4.6版Spot軟件拍攝。每一種染色方法至少有10張不同的樣本被拍攝，然后經肉眼篩選出可代表這一特定染色方法的圖片。

2 結果

2.1 福爾根染色鹽酸水解條件

福爾根染色鹽酸水解可以在多種條件下進行。為找到適合于JB-4包埋的斑馬魚視網膜福爾根染色的最佳鹽酸濃度，將4 μm厚的JB-4切片在Schiff試劑處理之前分別用1N、2N、3N、4N及5N的HCl進行不同時間的水解反應。然后通過肉眼觀察粉紅色的深淺判斷福爾根染色程度。我們發現鹽酸濃度越高、浸潤時間越長，則染色程度越強；反之，鹽酸濃度越低、浸潤時間越短，則染色程度越弱。但低濃度的鹽酸可以通過延長浸潤時間而提高染色強度。因此，為滿足快速水解的需要，推薦將JB-4包埋的組織切片浸潤于5N鹽酸中45 min。另外，3N鹽酸過夜處理也足以獲得相同的染色效果。

2.2 福爾根染色Schiff反應時間

Schiff 反應是醛基與Schiff試劑之間的共價凝集反應，Schiff反應的持續時間也會影響粉紅色終產物的數量。因此，我們比較了3N鹽酸過夜處理的4 μm厚JB-4切片經過不同時間Schiff浸潤后染色強度的變化。我們發現染色強度隨著Schiff浸潤時間的延長而增加，2 h染色最強。

2.3 切片厚度對細胞核可分辨度的影響

通過比較2 μm、3 μm、4 μm及6 μm厚的切片對福爾根染色及核邊界分辨度的影響，發現這三類切片的染色強度均足以看清視網膜各類細胞核。然而，切片越厚，相互重疊的臨近細胞核越多以致單個細胞核越難分辨(圖1A-D)。考慮到在切2 μm厚切片時，標本經常破碎，推薦使用3 μm厚切片以區分單獨的細胞核及觀察組織整體形態。

圖1組織切片厚度對細胞核可分辨度的影響。(A-D)在2μm組織切片(A)中單個細胞核比在3μm組織切片(B)、4μm組織切片(C)及6μm組織切片(D)中顯示出更清晰的核邊界。箭頭所指顯示臨近的細胞核相互重疊。(60×)

2.4 福爾根染色與亞甲天藍II、核固紅染色的區別

亞甲天藍II和核固紅是陽離子染料，它們通過與帶負電荷的分子間靜電結合而使組織染色。因為DNA分子是帶負電荷的，因此這兩種方法經常用于染細胞核。但它們也能使其它帶負電荷的細胞質分子染色，因此特異性低。通過比較2 μm厚的JB-4切片福爾根染色與亞甲天藍II及核固紅對細胞核的染色，發現亞甲天藍II及核固紅均產生很強的非特異性細胞質染色，很難分辨單一的視網膜細胞核。由于視錐細胞核本身染色弱，使得區分視錐細胞核染色及細胞質染色變得更加困難。我們試圖通過增加脫染時間而減弱細胞質染色背景。但過度的脫染洗滌時間并不奏效，因為這樣既減弱了細胞核信號又減弱了細胞質信號。實驗結果顯示經過30 min洗滌后細胞核和細胞質染色均變得非常微弱；過夜洗滌后，染色幾乎完全消失。而相比之下，共價反應的福爾根細胞核染色可耐受過度的洗滌。因此，盡管福爾根染色操作相對需要更長時間，但它較亞甲天藍II及核固紅染色更特異及穩固。

3 討論

福爾根染色是基于兩個基本的化學反應[11,12]。首先，鹽酸水解打破DNA分子堿基與脫氧核糖之間的結合，從而在脫氧核糖的一端生成了醛基。其次，DNA水解產生的醛基與Schiff試劑發生凝集反應產生粉紅色含有醌基的化合物，粉紅色化合物的多少與DNA分子的數量密切相關[11-13]。當生物樣本包埋于JB-4塑膠樹脂中，JB-4基質將阻止化學試劑的滲透從而減慢以上所述的化學反應。因此，與薄切片相比，盡管厚的JB-4切片包含更多的DNA，但對于福爾根染色而言，化學反應的減少表明染色強度可能不和切片厚度成正比。除此之外，厚切片由于光學顯微鏡垂直分辨率的局限性會破壞圖像質量[1]。因此，為了更好地觀察斑馬魚視網膜細胞核，需要尋求一個染色信號強度與圖像分辨率之間的平衡。綜上，我們系統地研究了鹽酸水解、Schiff反應及JB-4切片厚度如何影響斑馬魚視網膜細胞核的福爾根染色。

通過以上實驗結果，我們得出了一個最佳福爾根染色方法。它可以用于觀察JB-4包埋的斑馬魚視網膜細胞核及組織形態。方法如下:①在常溫下固定斑馬魚眼球于4%多聚甲醛溶液中過夜。②將固定后的眼球包埋于JB-4 樹脂中。③3 μm厚的切片用于觀察細胞核整體結構。④收集切片于載玻片上。⑤在常溫下將JB-4切片經3N鹽酸過夜處理或5N鹽酸浸潤45 min以水解DNA 分子。⑥將切片用蒸餾水洗滌10 min以去除過多的鹽酸。⑦在常溫下將經鹽酸水解的JB-4切片于Schiff試劑中浸潤2 h。⑧將切片用流水沖洗30 s，再用蒸餾水洗滌5 min以去除過多的Schiff試劑。⑨蓋玻片下中性樹脂封片，顯微鏡照相。

這個簡單可靠的染色方法可以用于細胞計數。

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