PEG-PLA-PGL/RGD涂層支架對(duì)冠脈支架置入術(shù)后再狹窄的影響

張基昌,宋春莉,劉 斌,趙 卓,李 倩,劉 佳,刁鴻英,魯 洋,于雲(yún)鵬

(吉林大學(xué)白求恩第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130041)

冠狀動(dòng)脈支架置入術(shù)后再狹窄一直是心臟病介入治療研究的熱點(diǎn)。目前應(yīng)用的藥物涂層支架如雷帕霉素與紫杉醇涂層支架，大大減少了再狹窄的發(fā)生率。但該兩種支架均是通過(guò)抑制細(xì)胞增殖來(lái)防止再狹窄，都是非平滑肌細(xì)胞選擇性藥物,在阻止平滑肌細(xì)胞增生的同時(shí)也阻止血管內(nèi)皮細(xì)胞增生,使支架被內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或難以被覆蓋，容易形成血栓[1，2]。故導(dǎo)致冠脈內(nèi)支架置入術(shù)后患者服用雙重或三重抗血小板藥物時(shí)間增長(zhǎng)，從而增加了患者的醫(yī)療費(fèi)用，增加了患者長(zhǎng)期雙重抗血小板治療出血風(fēng)險(xiǎn)，而且長(zhǎng)期內(nèi)皮修復(fù)不完全，會(huì)刺激內(nèi)膜增生導(dǎo)致再狹窄。目前普遍認(rèn)為在抑制平滑肌增殖的同時(shí)，加速內(nèi)皮損傷的修復(fù)更重要。同時(shí)加速內(nèi)皮修復(fù)受損內(nèi)膜可降低支架暴露于血液中時(shí)間，降低支架置入術(shù)后遠(yuǎn)期血栓發(fā)生率，減少患者長(zhǎng)期多重抗血小板治療的時(shí)間[4-7]。本研究應(yīng)用通過(guò)將支架表面接枝精氨酸-甘-天冬氨酸三肽聚合物(RGD),促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cell，EPC)在支架上附著，加速受損內(nèi)膜修復(fù)的途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)消除再狹窄，該研究在國(guó)內(nèi)外報(bào)道極少。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

316L不銹鋼裸支架(購(gòu)自樂(lè)普公司)，PEG-PLA-PGL/RGD(中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所提供)，HE染色劑；氯化鈉、鹽酸、枸櫞酸、枸櫞酸鈉、甲醛等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康良種小型豬共18只,均為雄性,月齡3-5個(gè)月，體重20-25 kg/只。隨機(jī)分為3組，即裸支架組，PEG-PLA-PGL/RGD支架組，紫杉醇涂層支架組，每組6只。常規(guī)喂養(yǎng)，術(shù)前觀察1周。術(shù)前3天起每只豬雙聯(lián)抗血小板藥物：拜阿司匹林100 mg日一次口服及氫氯吡格雷75 mg日一次口服，至相應(yīng)觀察終點(diǎn)時(shí)間結(jié)束藥物治療。麻醉采用速眠新2(846合劑)0.1 ml/kg 肌內(nèi)注射,豬四肢無(wú)力無(wú)法行走后,3%戊巴比妥鈉生理鹽水溶液0.2 ml/kg 耳緣靜脈推注，速度為2 ml/min,術(shù)中按需追加3%戊巴比妥鈉生理鹽水溶液，劑量為初始劑量1/4-1/5。

1.3 涂層支架的制備

生物可降解高分子聚乙二醇-聚乳酸-聚谷氨酸共聚物(PEG-PLA-PGL)的合成，PEG-PLA-PGL/RGD均由中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春支架涂層應(yīng)用化學(xué)研究所協(xié)助完成。

1.4 冠脈損傷模型制備及支架置入術(shù)

麻醉后,使豬仰臥于手術(shù)臺(tái)上，消毒鋪巾。常規(guī)手術(shù)準(zhǔn)備。分離右側(cè)股動(dòng)脈,穿刺并置入6F動(dòng)脈鞘管。經(jīng)動(dòng)脈鞘管給予肝素鈉150 U/kg,之后按照標(biāo)準(zhǔn)PTCA術(shù)步驟操作。選擇左前降支、回旋支和右冠狀動(dòng)脈中較為平直的血管段,定量冠狀動(dòng)脈造影 ( QCA)測(cè)定直徑,按照球囊/血管直徑比例為1.2-1.3∶1的比例，10-15大氣壓、15 s單次過(guò)度擴(kuò)張血管，釋放支架，形成冠狀動(dòng)脈損傷模型。退出球囊后造影確認(rèn),支架充分?jǐn)U張、無(wú)嚴(yán)重內(nèi)膜撕裂及血栓形成、前向血流TIMI 3級(jí)為手術(shù)成功。術(shù)后撤除導(dǎo)管,拔除股動(dòng)脈鞘,結(jié)扎動(dòng)脈。縫合包扎后將動(dòng)物送回動(dòng)物房,常規(guī)喂養(yǎng)。術(shù)后給予青霉素300萬(wàn)U抗感染。繼續(xù)雙聯(lián)抗血小板治療，劑量同術(shù)前。注意觀察動(dòng)物精神狀態(tài)、進(jìn)食情況、有無(wú)黑便、血尿等出血傾向。

1.5 標(biāo)本制備

分別在術(shù)后4及12周時(shí)每組選擇處死實(shí)驗(yàn)豬3頭，迅速取出心臟，置入含有肝素的生理鹽水中。從升主動(dòng)脈根部伸入7F擴(kuò)張管分別伸至左右冠狀動(dòng)脈開(kāi)口處，用上述液體沖洗冠狀動(dòng)脈3-4次，用止血鉗封扎升主動(dòng)脈及各心腔出口防止漏液。小心分離置入支架處血管段至少1 cm，包括支架置入血管部位的近端及遠(yuǎn)端，不可使血管與支架分離。置于4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋后硬質(zhì)切片機(jī)切片，間斷均勻橫向切片，切片厚度為4-5 μm，染色。制作成病理組織學(xué)切片，光鏡下行組織學(xué)定量評(píng)價(jià)。

1.6 病理形態(tài)學(xué)分析

由計(jì)算機(jī)圖像系統(tǒng)分別測(cè)定新生內(nèi)膜面積、管腔橫斷面積。新生內(nèi)膜面積為原始管腔和狹窄管腔面積之差(原始管腔面積- 狹窄管腔面積)，面積狹窄百分比由下列公式計(jì)算:面積狹窄百分比=100×[1-(狹窄管腔面積÷原始管腔面積)] 。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況

本實(shí)驗(yàn)研究了9只實(shí)驗(yàn)豬。手術(shù)操作順利，支架置入成功，擴(kuò)張完全。實(shí)驗(yàn)豬術(shù)后飲食、精神及排便正常，未見(jiàn)出血傾向。處死動(dòng)物后，未見(jiàn)心臟大體標(biāo)本有瘢痕等異常情況出現(xiàn)。

2.2 涂層支架一般性狀

光學(xué)顯微鏡觀察涂層支架擴(kuò)展時(shí)的順應(yīng)性,支架直徑達(dá)到4 mm時(shí),涂層無(wú)明顯裂開(kāi)、剝脫現(xiàn)象。

2.3 內(nèi)膜增生定量評(píng)價(jià)

在光鏡下可見(jiàn)，支架置入后第4周，三組支架表面均有內(nèi)膜覆蓋，但覆蓋程度及內(nèi)膜增生程度已有差異。紫杉醇組支架大部分已覆蓋完全，但仍有部分位置未被覆蓋，即內(nèi)皮化不完全，在覆蓋內(nèi)膜的位置未見(jiàn)明顯的內(nèi)膜增生；NIR組支架表面均有內(nèi)膜覆蓋，但內(nèi)膜相對(duì)較厚；RGD組支架表面有完整內(nèi)膜覆蓋，內(nèi)膜未見(jiàn)明顯增生。至第12周時(shí)，三組支架上內(nèi)膜均覆蓋完全，可見(jiàn)NIR組支架內(nèi)膜增生明顯，血管管腔較另兩組明顯狹窄，而紫杉醇支架組及RGD組內(nèi)膜厚度相當(dāng)，未見(jiàn)明顯增生。三組支架在第4周及第12周典型內(nèi)膜增生情況見(jiàn)圖1所示。由于未行電鏡下觀察，光鏡下觀察內(nèi)皮化不全及內(nèi)膜增生有一定局限性。

圖1 三組支架在第4周及第12周內(nèi)膜增生情況(25×)

通過(guò)表1中定量評(píng)價(jià)結(jié)果可見(jiàn)，在第4周及第12周，各組之間IEMA無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示各組在置入支架時(shí)，三組支架擴(kuò)張程度無(wú)差異。管腔面積狹窄百分?jǐn)?shù)(%AS)可以理解為單位面積上的內(nèi)膜增生量，可以相對(duì)更準(zhǔn)確的反應(yīng)內(nèi)膜增生的程度。第4周時(shí)，NIR組與紫杉醇支架組在%AS上表現(xiàn)出了顯著差異，但RGD組與另兩組比較均無(wú)差異，說(shuō)明在支架置入后4周內(nèi)，RGD組的內(nèi)皮化效果應(yīng)該介于NIR組及TAXUS組之間，但更傾向于內(nèi)皮化不全還是內(nèi)膜增生并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)支持。內(nèi)膜增生至12周時(shí)，NIR組%AS幾乎達(dá)到支架內(nèi)再狹窄的判定標(biāo)準(zhǔn)(50%)，而另兩組則狹窄不明顯。除TAXUS組與NIR組%AS表現(xiàn)出顯著性差異外，4周時(shí)，紫杉醇組與NIR組比較aP<0.05；12周時(shí)RGD組及紫杉醇組分別與NIR組比較，bP<0.05、cP<0.05，RGD組和紫杉醇組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，*P>0.05。

表1 三組支架內(nèi)膜增生病理組織學(xué)定量評(píng)價(jià)結(jié)果

RGD組與NIR組%AS差異也有了統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在第5到第12周內(nèi)，相對(duì)于NIR組內(nèi)膜的快速增長(zhǎng)，RGD組內(nèi)膜增生較緩慢。并且在兩個(gè)觀察點(diǎn)中，RGD組與攜帶了抗增殖藥物的紫杉醇組%AS均未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，RGD組支架材料在前期已證明了無(wú)細(xì)胞毒性，其上內(nèi)膜未顯著增生應(yīng)該是RGD有快速促內(nèi)皮化的作用，盡早完成支架表面內(nèi)皮化后降低了內(nèi)膜增生的發(fā)生率，起到了與抗增殖藥物相似的抗再狹窄效果。

3 討論

第一代藥物洗脫支架(Drug eluting stent ,DES)通過(guò)釋放細(xì)胞毒性藥物或細(xì)胞靜止藥物抑制平滑肌細(xì)胞增殖，從而減少了再狹窄的發(fā)生，但不可避免地對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞也產(chǎn)生了毒性作用，延緩內(nèi)皮化，增加了支架內(nèi)血栓尤其是晚期血栓的發(fā)生率，支架表面早期內(nèi)皮化可以修復(fù)受損的血管內(nèi)膜，減少支架內(nèi)再狹窄和血栓的形成，于是加速內(nèi)皮化進(jìn)程成為支架術(shù)后研究的熱點(diǎn)所在[1-3]。EPC的研究促使EPC捕獲支架的誕生，可以通過(guò)捕獲EPC促使其在支架處增殖、分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞從而修復(fù)受損血管內(nèi)膜，在之前的研究中人們發(fā)現(xiàn)了多種可以捕獲EPC的物質(zhì)并在支架上嘗試，但至今仍未有令人們十分滿(mǎn)意的結(jié)果，在捕獲EPC促內(nèi)皮化上因各種問(wèn)題導(dǎo)致內(nèi)皮化效果不佳[4，5-9]。本文選取了被很多研究者證明有確切地捕獲EPC的作用，并且可以同時(shí)捕獲內(nèi)皮細(xì)胞，因此在促進(jìn)內(nèi)皮化上有巨大優(yōu)勢(shì)。EPC捕獲支架通過(guò)加速內(nèi)皮化減少支架內(nèi)血栓及再狹窄的形成，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)驗(yàn)豬體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步觀察RGD支架與裸支架及紫杉醇支架對(duì)比，對(duì)支架上內(nèi)皮化及再狹窄的影響。

本研究將該新型EPC捕獲支架置入實(shí)驗(yàn)豬體內(nèi)，對(duì)比觀察與裸支架及紫杉醇支架對(duì)內(nèi)皮化和再狹窄產(chǎn)生的影響。4周時(shí)觀察到了紫杉醇組支架的內(nèi)皮化不完全現(xiàn)象，這主要是紫杉醇毒性造成的；而NIR支架出現(xiàn)了輕度的過(guò)度內(nèi)皮增殖；RGD組支架作用介于二者之間，能在4周內(nèi)很好的形成內(nèi)膜修復(fù)且沒(méi)有產(chǎn)生內(nèi)膜過(guò)度增殖，說(shuō)明RGD通過(guò)捕獲EPC及內(nèi)皮細(xì)胞加速了內(nèi)皮化進(jìn)程，使受損內(nèi)膜得到了及早修復(fù)。第12周時(shí)，NIR支架表面因內(nèi)膜增生過(guò)度幾乎造成再狹窄；紫杉醇組支架慢慢完成了內(nèi)皮化，本實(shí)驗(yàn)中未觀察到支架內(nèi)血栓形成，但內(nèi)皮化的延遲不可避免的會(huì)粘附、激活血小板；RGD組在8周時(shí)間內(nèi)也在繼續(xù)內(nèi)膜增生，但并未過(guò)度增殖。在內(nèi)膜增殖速度觀察上，RGD組主要在前4周完成了早期內(nèi)皮化，TAXUS組使內(nèi)皮化延遲。但兩組在抗再狹窄上未有明顯差異。因此，PEG-PLA-PGL/RGD涂層支架可以通過(guò)加速內(nèi)皮化完成血管內(nèi)膜修復(fù)，并且未觀察到再狹窄發(fā)生。雖然需要說(shuō)明的是，本實(shí)驗(yàn)是對(duì)PEG-PLA-PGL/RGD涂層支架促進(jìn)內(nèi)皮化的初步研究，因此選取的動(dòng)物例數(shù)較少，觀察時(shí)間較短，因此結(jié)果有局限性，將來(lái)可加大樣本量進(jìn)一步研究。

作者簡(jiǎn)介：宋春莉，女，副教授，博士，主要從事新型血管支架的基礎(chǔ)與臨床研究。

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