利用TAIL-PCR分離申克氏孢子絲菌T-DNA插入突變體側翼序列的研究

徐廷滔,白忠義，龍朋朋，張 攀，于保東

(1.吉林大學植物科學學院，吉林 長春130062；2.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033)

申克氏孢子絲菌(Sporothrixschenckii)是雙相型病原真菌，在自然條件下表現為菌絲相，而在體內和37℃為酵母相。申克氏孢子絲菌引起人和動物的皮膚、皮下組織及其附近淋巴系統的慢性感染，稱之為孢子絲菌病(Sporotrichosis)[1]。該病常常與皮膚的輕微外傷后接觸被病原菌污染的物質有關。臨床上孢子絲菌病分為淋巴管型、固定型及播散型。其中最常見的是淋巴管型，引起皮膚滲出、化膿，甚至潰爛。其次是固定型，常引起面部皮疹，多見于兒童。雖然播散型孢子絲菌病發生率不高，但該病如不及時治療，可引起死亡[2]。近年來，隨著抗腫瘤藥物、抗生素等的廣泛應用，以及惡性血液病和艾滋病等免疫受損人群的不斷擴大，播散型孢子絲菌病呈上升趨勢，嚴重威脅人類健康[3]。

隨著后基因組時代的到來，迫切需要了解大量未知基因的功能。農桿菌介導的T-DNA插入突變技術是通過反向遺傳學研究基因功能的重要方法,在多種植物及真菌中已獲得大量T-DNA插入突變體[4-6]。而T-DNA插入位點側翼序列的克隆是鑒定突變基因的關鍵步驟。熱不對稱交錯PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)由Liu和Whittier首先研究并報道[6]。TAIL-PCR以基因組DNA為模板，利用低退火溫度的簡并引物和高退火溫度的特異性嵌套引物，通過低特異性PCR和高特異性PCR交替的三輪溫度不對稱循環，擴增獲得特異性產物。由于TAIL-PCR具有操作簡單、快速、特異性強、重復性好、成本較低等優點，成為克隆已知序列側翼的常用方法。

目前，對申克氏孢子絲菌分子生物學研究剛剛起步，要深入了解其致病機制，需要對相關基因進行分離和分析。本研究以申克氏孢子絲菌T-DNA插入突變株為材料，利用TAIL-PCR方法分離突變菌株T-DNA插入位點側翼序列，為進一步挖掘申克氏孢子絲菌的功能基因，在分子水平上探討相關機制奠定基礎。

1 材料

1.1 菌株

申克氏孢子絲菌(S.schenckii)野生型及T-DNA插入突變菌株Ss1-Ss5由吉林大學中日聯誼醫院提供。

1.2 引物

本研究所用引物見表1，其中T-DNA-R和T-DNA-F為擴增T-DNA(left border -trpC-hph-right border)引物；LB1，LB2，LB3為TAIL-PCR左邊界嵌套引物；RB1，RB2，RB3為TAIL-PCR右邊界嵌套引物；AD1，AD2，AD3，AD4為隨機引物，上述引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。

表1 本研究所用引物

2 方法

2.1 申克氏孢子絲菌基因組DNA的提取

將申克氏孢子絲菌野生型和突變菌株(Ssl-Ss5)接種于5 ml PDB(potato dextrose broth)培養基，于28℃，100 r/min振蕩培養5 d。挑取培養的菌絲體，轉移至1.5 ml離心管內，10 000 r/min 離心1 min，收集菌絲體，參照文獻提供的方法提取孢子絲菌基因組DNA[8,9]。

2.2 T-DNA插入突變體的PCR 驗證

利用提取的基因組DNA，以野生型申克氏孢子絲菌為陰性對照，PCR擴增突變菌株(Ssl-Ss5)的T-DNA。PCR反應程序為95℃,2 min后進入循環程序：94℃,30 s；53℃,30 s；72℃，1 min，共30個循環，最后，于72℃延伸10 min[10]。

2.3 TAIL-PCR分離突變體T-DNA側翼序列

根據T-DNA插入載體pBHt1上的T-DNA序列設計左邊界和右邊界兩套TAIL-PCR特異性嵌套引物LB1、LB2、LB3和RB1、RB2、RB3，同時設計四條隨機簡并引物AD1～AD4，TAIL-PCR擴增體系及擴增條件見表2和表3。TAIL-PCR是基于簡并引物和特異引物的熱不對稱循環，分為三輪反應：第一輪PCR包括5次高特異性循環、1次低特異性循環、10次較低特異性循環和15次熱不對稱循環；第二輪PCR是以第一輪PCR反應產物稀釋50倍作為模板，通過15次熱不對稱循環，使特異產物選擇性放大，而非特異性的產物降到極低的濃度；第三輪PCR又將第二輪PCR反應產物稀釋50倍作為模板，再通過30次熱不對稱循環，使特異產物進一步得到放大。通過三輪PCR反應即可獲得T-DNA鄰近的側翼序列。TAIL-PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。TAIL-PCR產物回收后，以RB-3或LB-3作為引物，送北京英駿生物技術有限公司進行測序。

表2 TAIL-PCR反應體系的組成

3 結果

3.1 T-DNA插入突變株Ss1-Ss5分子鑒定

根據申克氏孢子絲菌突變菌株Ss1-Ss5中T-DNA(left border -trpC-hph- right border)左臂、右臂設計特異性引物T-DNA-F和T-DNA-R(兩者之間片段大小為2 100 bp)，對突變菌株進行PCR鑒定。結果從這5株突變體中均擴增出一條大小約2 100 bp的條帶，而野生菌株無特異性條帶，表明T-DNA已整合到申克氏孢子絲菌Ss1-Ss5基因組中(見圖1)。

表3 TAIL-PCR反應程序

*，**，***和****分別代表5，10，15和30個循環。

3.2 T-DNA插入突變株側翼序列的分離

取TAIL-PCR的第二輪和第三輪PCR擴增產物，進行瓊脂糖凝膠電泳，結果這五株突變體，在第二輪擴增時均獲得2-3條PCR產物條帶，特異性較差；經過第三輪擴增后，獲得大小為300 bp左右的特異條帶，且第三輪PCR產物比第二輪PCR產物小100 bp左右(見圖2)。產物經凝膠回收試劑盒純化后進行測序。序列分析表明，利用TAIL-PCR從五株突變株中均獲得申克氏孢子絲菌T-DNA插入位點側翼序列，且側翼序列之間無同源性(見圖3)。

4 討論

T-DNA插入位點側翼序列的克隆是分離功能基因的關鍵步驟。目前已建立了幾種用于克隆T-DNA插入位點側翼序列的方法，如接頭連接介導PCR、反向PCR、質粒營救及TAIL-PCR等[11,12]。而由Whitter和Liu等首先研究并報道的TAIL-PCR是利用嵌套的特異引物和簡并引物組合，以基

因組DNA作為模板，利用引物長度和特異性的差異設計不對稱的溫度循環，然后通過三輪反應來擴增特異性的目標產物，獲得已知序列的側翼序列[7]。

利用TAIL-PCR擴增側翼序列與其它方法相比具有如下優點[13]:首先TAIL-PCR直接以基因組DNA為模板篩選目標序列，可快速獲得目標片段。操作簡單、快速，省去了酶切、連接、加尾等繁瑣步驟。其次，TAIL-PCR技術不涉及連接反應，實驗結果較穩定，重復性好，準確可靠。另外，接頭連接介導PCR、反向PCR等方法均需要DNA連接酶、限制性內切酶及對引物進行特殊修飾，而TAIL-PCR只需特異引物和簡并引物，降低實驗成本。

本實驗采用TAIL-PCR技術，從5株申克氏孢子絲菌突變體中克隆到T-DNA插入位點的側翼序列，該實驗結果表明TAIL-PCR是簡單、快速、高效分離申克氏孢子絲菌T-DNA側翼序列的有效方法，為深入挖掘申克氏孢子絲菌的功能基因，探討雙相型原真菌的分子機制奠定基礎。

參考文獻：

[1] Alexandro Bonifaz,Denisse Vázquez-González.Diagnosis and Treatment of Lymphocutaneous Sporotrichosis:What Are the Options[J].Current Fungal Infection Reports，2013,7(3):252.

[2]Luisa HM Miranda,Fátima Concei?o-Silva,Leonardo P.Quintella,et al.Feline sporotrichosis:Histopathological profile of cutaneous lesions and their correlation with clinical presentation[J].Microbiology and Infectious Diseases，2013,36(4):425.

[3]Silva-Vergara ML,Maneira FR,De Oliveira RM,et al.Multifocal sporotrichosis with meningeal involvement in a patient with AIDS[J].Med Mycol，2005,43,187.

[4]Maruthachalam K,Klosterman SJ,Kang S,et al.Identification of Pathogenicity-Related Genes in the Vascular Wilt Fungus Verticillium dahliae by Agrobacterium tumefaciens-Mediated T-DNA Insertional Mutagenesis[J].Molecular Biotechnology，2011,49(3)：209.

[5]Huser A,Takahara H,Schmalenbach,et al.Discovery of pathogenicity genes in the crucifer anthracnose fungus Colletotrichum higginsianum,using random insertional mutagenesis[J].Mol Plant Microbe Interact，2009,22,143.

[6] Zhang Y， Li G，He D,et al.Efficient insertional mutagenesis system for the dimorphic pathogenic fungus Sporothrix schenckii using Agrobacterium tumefaciens[J].J Microbiol Methods,2011,84,418.

[7] Liu YG,Robert F Whitter.Thermal asymmetric interlaced PCR:automatable amplification and sequencing of insert end fragment from P1 and YAC clones for chromosome walking[J].Genomics,1995,25:674.

[8]Zhang YJ,Zhang S,Liu XZ,et al.A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains[J].Letters in applied microbiology,2010,51(1):114.

[9]Xiaoyan Qu,Baodong Yu,Jinliang Liu,et al.MADS-Box Transcription Factor SsMADS Is Involved in Regulating Growth and Virulence in Sclerotinia sclerotiorum[J].Int J Mol Sci,2014,15:8049.

[10]Sun L,Yan M,Ding Z,et al.Improved dominant selection markers and co-culturing conditions for efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Ustilago scitaminea[J].Biotechnology letters,2014,1:6.

[11] Erster O,Liscovitch M.A modified inverse PCR procedure for insertion,deletion,or replacement of a DNA fragment in a target sequence and its application in the ligand interaction scan method for generation of ligand-regulated proteins[J].Methods Mol Biol,2010,634:157.

[12]O'Malley RC,Alonso JM,Kim CJ,et al.An adapter ligation-mediated PCR method for high-throughput mapping of T-DNA inserts in the Arabidopsis genome[J].Nat Protoc.2007,2:2910.

[13] Reimer L C,Spura J,Schmidt-Hohagen K,et al.High-Throughput Screening of a Corynebacterium glutamicum Mutant Library on Genomic and Metabolic Level[J].PloS one,2014,9(2):e86799.