TPCA-1對脂多糖誘導的角膜基質成纖維細胞作用及其機制的研究

姜 宏,仲 煒,閆東君

(吉林大學中日聯誼醫院 眼科,吉林 長春130033)

通過研究TPCA-1影響LPS刺激角膜基質成纖維細胞分泌炎性細胞因子(IL-1,TNF-α,IL-6)和趨化因子(IL-8)以及細胞表面ICAM-1中的作用，旨在觀察TPCA-1對脂多糖誘導的角膜基質細胞分泌炎性細胞因子、趨化因子、細胞間黏附因子抑制作用及其信號轉導途徑,為臨床治療角膜潰瘍提供有益的線索。

1 材料與方法

1.1人角膜基質細胞的培養及鑒定組織來源于角膜移植術后剩余角膜材料,供體為健康成年人。采用消化培養法,用小鼠抗人波形蛋白及角蛋白單克隆抗體進行細胞鑒定。

1.2ELISA法檢測角膜基質細胞LPS作用前后培養上清中分泌IL-1,TNF-α,IL-6,IL-8水平分組為:① 陰性對照組:加入不含有任何血清或藥物的同體積MEM培養液；② 溶媒對照組:單純給予含有0.5%人血清(AB型)的MEM培養液；③LPS組:給予含有0.5%人血清(AB型)及LPS 100 ng/ml的MEM培養液。

1.3ELISA檢測不同濃度的TPCA-1對LPS作用前后分泌IL-6,IL-8蛋白的作用ELISA檢測試劑盒按說明書操作。并根據此結果進行下一步試驗。

1.4蛋白質印跡雜交(Westernblot)法檢測TPCA-1對LPS作用后細胞IL-6,ICAM-1的影響分組為:①陰性對照組:給予等體積MEM培養液；②LPS組:給予含有0.5%人血清(AB型)的LPS(100 ng/ml)；③TPCA-1組:給予TPCA-1(1.0 μM)預處理1小時后,給予含有0.5%人血清(AB型)的LPS(100 ng/ml)。

以上3組各自作用24 h后,提取細胞中總蛋白,進行蛋白含量的測定,蛋白質印跡雜交,將Westem印跡雜交X線片圖像掃描入計算機,采用Quanty one軟件進行定量分析。

1.5逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)方法檢測TPCA-1LPS刺激前后細胞IL-6,IL-8,ICAM-1的影響分組同1.4。PCR使用的引物包括:① GAPDH:上游5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’ ,下游5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’,用這對引物可擴增出長度為447 bp的GAPDH cDNA片段； ② IL-6:(+)5′-GGA GAC TTG CCT GGT GAA-3′,(-)5′-CTG AGG TGC CCA TGC TAC-3′,用這對引物可擴增出長度為330 bp的IL-6 cDNA片段； ③ IL-8:(+)5′-ATG ACT TCC AAG CTG GCC GTG GCT-3′,(-)5′-TCT CAG CCC TCT TCA AAA ACT TCT C-3′,用這對引物可擴增出長度為293 bp的ICAM-1cDNA片段。 ④ ICAM-1:(+)5′-TGA CCA GCC CAA GTT GTT GG-3′,(-)5′-ATC TCT CCT CAC CAG CAC CG-3′,用這對引物可擴增出長度為380 bp的ICAM-1cDNA片段。取5 μl PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/ml溴化乙錠)3 V/cm電泳30-50 min,紫外燈下照相,用凝膠成像處理系統對每一樣品PCR產物擴增的特異性片斷(IL-6、IL-8、ICAM-1和GAPDH)進行輝度掃描,以GAPDH密度作為參考定量標準,標本目的基因條帶的光密度參數與內參基因GAPDH條帶的光密度參數之比值作為該標本mRNA的相對定量。

1.6免疫組化染色檢測TPCA-1對LPS作用前后NF-κB的分布及表達實驗細胞的準備及分組同1.5,免疫組化染色按試劑盒說明書操作。

2 結果

2.1ELISA法檢測角膜基質細胞LPS作用前后分泌IL-1,TNF-α,IL-6,IL-8水平各組均未檢測到IL-1、TNF-α,與陰性對照組比較,人血清組分泌IL-6、IL-8因子水平無顯著差異(P>0.05)；LPS組分泌IL-6、IL-8水平明顯高于陰性對照組(P<0.01)。

2.2ELISA檢測不同濃度的TPCA-1對LPS作用前后分泌IL-6,IL-8蛋白的影響在無LPS作用下,不同濃度的TPCA-1作用后IL-8的基礎分泌與陰性對照組比較無顯著差異(P>0.05)；IL-6的基礎分泌與陰性對照組比較明顯降低(P<0.05),作用隨TPCA-1濃度增加而增大,具有濃度依賴性。LPS作用后,各濃度的TPCA-1對IL-6、IL-8的影響與LPS組比較均有顯著差異(P<0.05),作用隨TPCA-1濃度增加而增大,具有濃度依賴性。

2.3蛋白質印跡雜交(Westernblot)法檢測TPCA-1應用對LPS作用后細胞IL-6,ICAM-1蛋白的影響陰性對照組表達IL-6及ICAM-1蛋白,LPS作用后表達水平增高,與陰性組比較有顯著性差異(P<0.01)。與LPS組比較,LPS+TPCA-1組能夠明顯抑制角膜基質細胞IL-6及ICAM-1的表達(P<0.01)。

2.4RT-PCR檢測TPCA-1應用對LPS作用后細胞IL-6,IL-8,ICAM-1的影響陰性組mRNA水平表達IL-6、IL-8及ICAM-1,LPS作用后表達水平增高,與陰性組比較有顯著性差異(P<0.05)。LPS+TPCA-1組能夠明顯抑制角膜基質細胞IL-6、IL-8及ICAM-1在mRNA水平的表達,與LPS組比較有顯著性差異(P<0.05)。

2.5免疫組化染色檢測TPCA-1應用對LPS作用前后細胞核NF-κB表達細胞爬片行NF-κB免疫組織化學染色,可見正常培養的人角膜基質成纖維細胞核呈深藍色,LPS作用后細胞核黃褐色陽性著染,TPCA-1抑制后給予LPS作用細胞核染色為深藍色陰性。

3 討論

角膜基質成纖維細胞在角膜防御和炎癥反應中有重要作用。這些細胞不僅通過對炎性細胞因子發生反應,還可以直接和細菌相互作用誘導炎性細胞局部浸潤。成纖維細胞依其所在身體的不同部位和局部刺激物而表現不同的結構和功能特性[1],在離體培養后他們的不同表現型能夠維持不變[2，3]。角膜、皮膚、肺等不同組織來源的成纖維細胞細胞因子調節TARC表達是不同的[4,5],成纖維細胞對LPS的應答反應也因組織來源不同而不同。例如,肺成纖維細胞在LPS刺激時表達MCP-1而不表達IL-8[6],現在我們證實角膜基質成纖維細胞在LPS刺激時則表達IL-8。成纖維細胞對LPS或其他炎性介質的不同反應,可能構成了不同組織在炎癥反應中的不同特征。細胞因子介導的細胞信號系統,被認為在很多結締組織和上皮組織構成器官的發展、內環境穩定和創傷愈合中,在結構和功能上發揮最重要的作用。角膜因為沒有像皮膚等器官那樣的血管、皮脂腺、毛囊或混雜其他組織,在研究信號系統時成為特殊的模型[7]。

本研究結果提示TPCA-1通過抑制炎性細胞因子表達可能會抑制炎性細胞的趨化,對免疫細胞和組織固有細胞各自發揮多種作用。IKK-2的小分子抑制物TPCA-1最近被發現有希望用于治療炎癥性疾病如哮喘[8]、關節炎[9]以及眼部堿燒傷等情況的動物模型[10,11],并且安全有效。最近有人證實中性粒細胞刺激角膜基質膠原降解[12],炎性細胞和角膜固有的基質成纖維細胞的相互作用在角膜炎癥中發揮重要的作用。TPCA-1可以對IL-6,IL-8及細胞表面ICAM-1有顯著的抑制作用提示TPCA-1在抑制感染性角膜炎癥中可能發揮更重要的作用。它是否有副作用尚需進一步探討。

在原始上皮和內皮細胞,地塞米松抑制了NF-κB依賴的轉錄活性,但不改變IB水平或NF-κB的核轉位。我們證實了相似的機理出現在角膜基質成纖維細胞。IKK-2阻滯劑在抑制脂多糖誘導的角膜基質成纖維細胞炎性因子表達和膠原降解方面與地塞米松有相似作用,但是兩種藥物會發揮不同的作用機理[12,13]。IKK-2對NF-κB的激活發揮中心作用[14]。我們從實驗中證實,選擇性IKK-2受體抑制劑TPCA-1對抑制脂多糖誘導的角膜基質成纖維細胞表達和分泌IL-6、IL-8以及細胞表面ICAM-1。

我們證實了IKK-2受體阻滯劑(TPCA-1)能在炎癥反應中抑制IL-6、IL-8、ICAM-1等表達,是由于它阻斷了IB磷酸化和降解以及繼發的NF-κB核轉位。提示IKK-2受體阻滯劑(TPCA-1)可能成為治療角膜潰瘍除地塞米松外的另一種選擇或補充。可能成為治療角膜潰瘍藥物發展方面新的選擇。

以文章中的實驗結果作為前期工作和基礎,我們可以進一步深入探討角膜炎癥和角膜基質膠原降解的信號轉導機制。并利用LPS建立角膜潰瘍動物模型,進而進行體內試驗,探討TPCA-1抑制角膜基質膠原降解及角膜潰瘍的機制,從而為臨床上治療角膜潰瘍這一嚴重致盲眼病提供重要的參考依據。

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