自身免疫性肝病患者外周血Th17與Treg細胞及其相關(guān)因子表達的研究

王 波，李 志，陶 晶，楊婷婷，邵思佳

(1.大連市中心醫(yī)院 檢驗科,遼寧 大連116033；2.大連醫(yī)科大學(xué) 檢驗醫(yī)學(xué)院,遼寧 大連116044)

自身免疫性肝病(Autoimmune Liver Diseases，AILD)是以肝臟為相對特異性免疫病理損傷器官的一類病因尚未明確的慢性肝病，主要包括：自身免疫性肝炎(AIH)、原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)和原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)以及這三種疾病中任何兩者之間的重疊綜合征[1]。人們對AILD的研究已深入到參與維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的細胞群中,特別是CD4+T細胞亞群可能與該病的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系。本研究通過檢測AILD患者外周血Th17 與Treg細胞亞群比例及其相關(guān)細胞因子的變化，探討Th17、Treg 細胞的異常在AILD發(fā)病中的意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集2013年1月至2014年3月入大連市中心醫(yī)院和大連市第六醫(yī)院確診的AILD患者46例，其中AIH為28例，PBC為18例。由于PSC患病率低，本文不對其進行分組分析。將患者組細分為AIH組和PBC組。AIH的診斷標準參照1999年國際AIH小組修正的AIH臨床評分標準[2]。PBC診斷標準參照最新的2000年美國肝病學(xué)會(AASLD)關(guān)于PBC的臨床指導(dǎo)建議[3]。46例患者中女38例，男8例,年齡范圍24-75歲；其中AIH組共28例，男5例，女23例，平均年齡(50.78±25)歲；PBC組共18例，男3例，女15例，平均年齡(64.3±14)歲。20名健康體檢者作為對照組(男5例，女15例)。三組對象一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 主要試劑與儀器

CD3FITC,CD4-PC5，CD4-FITC,CD25-PC5及固定破膜劑購自美國Beckman公司，PE-IL-17,PE-IFN-γ購自美國eBioscience公司，佛波酯(PMA)、離子霉素(Ionomycin)、莫能霉素(monensin)購自美國Sigma公司，IL-17和TGF-β的ELISA試劑盒購自美國R&D公司，流式細胞儀，酶標儀儀器為瑞典SUNRISE酶標儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 Th17細胞和Treg細胞的流式檢測 分離出外周血單核細胞，在分離好的單核細胞及對照組中加入CD3和CD4的酶標抗體進行表面標記，用于Th17細胞的標記；同時取外周全血200 μl及對照組加入CD4和CD25的單抗，混勻避光孵育20 min。孵育好的全血樣本PBS洗滌后，進行固定破膜。最后加入酶標FoxP3抗體進行細胞內(nèi)細胞因子的標記，對照管加入FoxP3對照抗體，孵育30 min。而孵育后的PBMCs標本用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌，并加入到特殊培養(yǎng)液中(含新生牛血清、刺激劑、莫能霉素和離子霉素)，放入37°溫箱孵育18-20 h。培養(yǎng)后的細胞及對照組同樣進行固定破膜之后加入酶標IL-17抗體和對照抗體，孵育30 min后PBS洗滌。最后，應(yīng)用流式細胞儀測定標記細胞的熒光強度。

1.3.2 酶聯(lián)免疫法檢測血漿中IL-17和TGF-β的濃度 按照ELISA試劑盒說明書進行細胞因子IL-17和TGF-β的測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 Th17與Treg細胞的檢測

AIH組和PBC組患者PBMCs中Th17細胞比例高于對照組(P<0.01),Treg細胞顯著低于對照組(P<0.05)，見表1。

2.2 IL-17與TGF-β的表達

AIH組和PBC組患者IL-17的含量較對照組升高(P<0.05)，血清TGF-β的含量較對照組降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，詳見表2。

表1 AIH組、PBC組與對照組外周血中Th17、Treg細胞所占比例

注：與對照組相比，*P<0.01，**P<0.05

表2 AIH組、PBC組和對照組血清中IL-17和TGF-β的含量

注：與對照組相比，*P<0.01，**P<0.05

3 討論

AILD屬于自身免疫性疾病,該病是以自身抗體存在于多種循環(huán)中為主要特點，女性易患，對糖皮質(zhì)激素治療良好，有顯著的自身免疫的發(fā)病基礎(chǔ)[4]。

Th17細胞由IL-23誘導(dǎo)分化生成，以產(chǎn)生IL-17為特征，可以抵抗Th1和Th2細胞不能抵抗的細胞外細菌和真菌感染，盡管Th17細胞在機體防御方面發(fā)揮重要作用，但近年來卻因其參與介導(dǎo)許多自身免疫性疾病的發(fā)展而備受關(guān)注[5]。本實驗初步研究了Th17及IL-17在AILD患者外周血中的表達，結(jié)果顯示Th17及IL-17相比對照組均呈高表達，結(jié)果與國內(nèi)外研究結(jié)果相符[6,7]。AIH組中Th17細胞增多，因為AIH病理變化主要表現(xiàn)為肝細胞損傷，Th17細胞可作為中介，通過數(shù)量增加，使更多的IL-22在炎癥部位聚集從而限制肝臟損傷，進而維持機體的穩(wěn)態(tài)。在多數(shù)研究中，AIH時Th17數(shù)量及其相關(guān)細胞因子明顯增加與肝臟炎癥程度及纖維化程度相關(guān)，這可能是Th17細胞和肝細胞之間的正反饋調(diào)節(jié)加劇了炎癥過程功能性。PBC組中IL-17和Th17細胞顯著增加，根據(jù)Harada等[8]研究，可知道 IL-17陽性細胞浸潤主要存在于PBC患者受損膽管，故外周血Th17細胞和IL-17表達水平也明顯升高。受損膽管周圍細胞因子誘導(dǎo)IL-17的產(chǎn)生，從而促進Th17等炎癥細胞的移行，加劇慢性膽管炎發(fā)生。

本研究中另一類CD4+T細胞-調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)是1995年被Sakagochi等發(fā)現(xiàn)并命名。自身免疫病機制研究水平不斷提升，人們已經(jīng)認識到Treg細胞既能防止自身免疫疾病的發(fā)生，也能夠限制免疫防御中T、B細胞過度活化，避免造成組織損傷[9]。細胞-細胞接觸模式和分泌抑制性因子(如TGF-β等)等是Treg 細胞發(fā)揮免疫抑制作用的機制[10]。在本研究中，AILD患者Treg細胞和TGF-β含量相比對照組呈低表達且有統(tǒng)計學(xué)意義，這與已有研究結(jié)果相符合[11]。在正常條件下,肝內(nèi)抗原提呈細胞激活CD4+T細胞可以被Treg抑制,而在感染條件下,肝細胞可以抵抗Treg的抑制作用,使免疫耐受轉(zhuǎn)為免疫應(yīng)答，進而患者組外周血Treg數(shù)量降低。除此之外，患者中TGF-β的分泌卻明顯低于對照組。正常狀態(tài)下，Treg細胞與靶細胞直接接觸引起本應(yīng)該TGF-β分泌增加，但實驗數(shù)據(jù)低于對照組，因而可推斷AILD患者外周血Treg功能受損。由此推測，Treg在AILD發(fā)生發(fā)展中起保護作用，恢復(fù)患者免疫穩(wěn)態(tài)，緩解患者的炎癥通過調(diào)節(jié)其數(shù)量和功能得到改善。

維持機體免疫系統(tǒng)的平衡常通過CD4+T細胞亞群之間在功能和分化過程中相互抑制而完成的(如：Th1和Th2細胞)。通過本實驗，我們也可推知Th17/Treg 細胞亞群也可能存在典型的互相抑制現(xiàn)象。實驗表明在Th17升高的同時，Treg數(shù)量是減少的。正常機體內(nèi)，初始CD4+T細胞分泌TGF-β參與免疫調(diào)節(jié)，在TGFβ和IL-6的共同誘導(dǎo)下分化Th17，分泌IL-17，參與炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病。AILD患者，肝細胞受損，TGF-β分泌降低，由于TGF-β同時分化Th17和Treg，但是Th17細胞和Treg的分化是相互排斥的，而IL-6、IL-10、IL-23等細胞因子決定了二者分化的相對比例。因此在研究AILD發(fā)病機制時應(yīng)多考慮各種細胞因子的相互作用及微環(huán)境對細胞性質(zhì)的影響等。

綜上所述，Th17細胞與Treg細胞的失衡可能是導(dǎo)致AILD患者中肝臟自身免疫功能的紊亂，誘導(dǎo)AILD的產(chǎn)生的原因。評估外周血和肝臟內(nèi)Treg細胞和Th17細胞環(huán)境下的二者功能及其相互關(guān)系將對自身免疫性肝病的發(fā)病機制提供新的治療手段，通過對Th17細胞/Treg細胞平衡的干預(yù)影響，從而達到預(yù)防和治療疾病的目的。

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