卵巢上皮性癌中Livin蛋白的表達及臨床意義

曹 璐，秦 瑞，劉俊寶

(吉林大學中日聯誼醫院 婦產科，吉林 長春130033)

Livin(KIAP/ML2IAP)基因是近來新發現的抑制凋亡蛋白家族(IAPs,inhibitors of Apoptosis protein)的成員，其在腫瘤組織中特異性高表達的特點使之成為研究的熱點，目前的研究也表明，此特點有可能為腫瘤的早期診斷、基因治療和細胞治療提供新靶點[1,2]。它可以選擇性的與胱天蛋白酶結合并且抑制其活性，特別是對caspase-3、-7、-9活性的抑制，從而起到阻斷凋亡受體的作用[3-5]。本實驗應用免疫組織化學法檢測Livin蛋白在正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤組織及卵巢上皮性癌中的表達，以期在卵巢癌的診治中起到一定的指導意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取吉林大學中日聯誼醫院2008年1月-2009年10月間手術切除的組織標本，其中正常卵巢組織20例、卵巢良性上皮性腫瘤組織20例和卵巢上皮性癌組織60例。患者的病例病理資料完整，年齡在35-77歲之間，平均年齡45歲，所有患者術前都沒有進行放、化療和各種激素治療，也沒有合并其他任何系統的惡性腫瘤。卵巢上皮癌標本根據國際婦產科聯盟(FIGO,International Federation of Gynecology and Obstetrics)標準進行臨床分期和病理組織學分級。其中Ⅰ、Ⅱ期共30例，Ⅲ、Ⅳ期共30例，高分化組(G1)16例，中分化組(G2)12例，低分化組(G3)32例，按組織學分型漿液性囊腺癌 25例， 粘液性囊腺癌25例，子宮內膜樣癌10 例。

1.2 方法

Livin兔抗人單克隆抗體(濃縮型)購于北京博奧森生物技術有限公司，Livin抗體工作濃度為1∶100。多聚HRP/AP免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色液均購自北京中杉金橋生物制品有限公司。具體操作按試劑盒說明書嚴格進行，以PBS 代替一抗設立陰性空白對照。

1.3 結果判定

每張切片均在雙盲下進行判定，陽性表達為鏡下組織細胞結構清晰，在細胞胞漿內出現黃色或棕黃色顆粒，且染色明顯高于背景。根據免疫組化評分方法對陽性細胞著色強度記分，然后在高倍鏡下連續計數1000個細胞，對陽性細胞所占百分比進行評分，根據兩者結果進行分析，取兩者評分之乘積，結果>3分為陽性，0-3分判為陰性。

1.4 統計方法

顯著性檢驗采用χ2檢驗，當T<1或n<40 采用精確概率法，求P值。所有數據統計都在SPSS17.0軟件上進行。

2 結果

2.1 正常卵巢組織中、卵巢良性腫瘤組織、卵巢上皮癌中Livin蛋白的表達

Livin蛋白陽性顆粒呈棕黃色，主要在細胞質中表達，偶見于細胞核內，其在正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤組織中的表達率呈現逐漸遞增的趨勢，依次為5.0%、15.0%、65.0%，可見卵巢上皮癌組織中Livin的表達明顯高于正常卵巢組織和卵巢良性腫瘤組織，三者之間的陽性表達率比較差異非常顯著，有統計學意義(χ2=30.03，P<0.05)。卵巢上皮癌組織和正常卵巢組織中Livin的表達有明顯差異(χ2=21.60，P<0.05)；同時和卵巢良性腫瘤組織中Livin的表達相比亦有明顯差異(χ2=15.07，P<0.05)；而正常卵巢組織和卵巢良性腫瘤組織中Livin的表達無明顯統計學意義(χ2=0.28，P>0.05)。詳見表1，圖1-圖2。

表1 Livin蛋白在不同卵巢組織中的表達

圖1Livin在漿液性囊腺癌中的陽性表達(SP×400)圖2Livin在卵巢子宮內膜樣癌中陽性表達(SP×400)

2.2 Livin蛋白的陽性表達與卵巢上皮癌臨床病理特征的關系

Livin蛋白在卵巢上皮性癌高分化組中的陽性表達率為43.8%，中分化組的陽性表達率為50.0%，低分化組中表達率為81.3%，三組之間進行比較，χ2=8.08，P<0.05，Livin的表達存在明顯統計學差異。可見Livin的陽性表達率隨著組織病理學分級的升高而逐漸增加。

在手術病理分期中Ⅰ、Ⅱ與Ⅲ、Ⅳ期陽性表達率分別為56.7%、73.3%，二者比較差異不顯著，無明顯統計學意義(χ2=1.83，P>0.05)。

在漿液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、子宮內膜樣癌中陽性表達率依次為68.0%、60.0%、70.0%，Livin的表達在不同組織學類型中無明顯差異，無統計學意義(χ2=0.48，P>0.05)。見表2。

表2 Livin蛋白的陽性表達與卵巢上皮癌臨床病理特征的關系

3 討論

卵巢惡性腫瘤是女性生殖系統常見三大惡性腫瘤之一，其中卵巢上皮性惡性腫瘤占卵巢惡性腫瘤的85%-90%。由于卵巢癌缺乏特異性早期發病指標，缺乏有效的早期診斷以及可靠的篩查方法，使其早期診斷率低，70%以上的患者發現時已屬晚期，5年生存率僅為25%-30%。且近年來，卵巢惡性腫瘤在我國發病率呈上升趨勢，趨向于年輕化，已經成為嚴重威脅婦女生命的惡性腫瘤。細胞凋亡受阻在腫瘤的發生、發展中起著重要作用，所以對細胞凋亡基因的研究成為了熱點。

本實驗通過在20例正常卵巢組織中檢測Livin蛋白發現僅有1例呈低表達，其余均無表達，這與國內的研究發現[6，7]Livin蛋白在正常成人的大多數終末組織中(除胎盤)低表達或者不表達的結論是一致的。Vucic等[8]檢測到在肺癌、黑色素瘤、直腸癌及結腸癌中Livin呈現陽性表達。Yagihashi等[6]用PT-PCR檢測發現Livin在結腸癌細胞系和胰腺癌細胞系中都呈過度表達。另外又用ELISA方法檢測35名胃腸道腫瘤病人血清中的抗Livin抗體，發現其在胃腸道腫瘤中的陽性率比抗survivin抗體的陽性率都高[9]。本研究通過免疫組化法檢測出Livin在卵巢上皮性癌中陽性表達率亦高達65%，由此推斷Livin可能成為一個新的腫瘤抗原。Livin在卵巢上皮性癌組織中的表達顯著高于正常卵巢組織及卵巢良性上皮性腫瘤，并與后兩者之間存在明顯的統計學差異，由此推測Livin蛋白的高表達在卵巢上皮性癌的發病過程中可能發揮了重要作用。

Gazzaniga等[10]對30例膀胱癌病人進行Livin基因表達水平檢測后隨訪，發現Livin呈陰性組的病例比陽性組復發間隔時間顯著延長(27.5個月，2.5個月)，從而推測Livin的表達可能與腫瘤的復發存在某種相關性。在本研究中，Livin蛋白在卵巢上皮性癌高分化組、中分化組、低分化組中的表達存在著顯著性差異，其表達強度隨著組織病理學分級逐漸升高而增強，預示著腫瘤更具有侵襲性和不良的預后，并且卵巢癌的組織分級是一判斷預后的獨立因素，因此Livin可以作為判斷腫瘤惡性程度及預后的指標，Livin在卵巢上皮性癌中的高表達可能預示著該腫瘤惡性程度高，預后差，易復發。

Kasof[11]認為Livin的細胞內分布與Survivin相似，即既在胞質內表達，也在胞核內表達，而本研究通過免疫組化方法，檢測出Livin主要在胞質內表達，偶見于胞核中。Kasof等[11]還通過實驗證明了Livin mRNA表達減少可促使caspase活性增加及腫瘤細胞凋亡，提示了以Livin作為靶點治療腫瘤的可能。Mertens等[12]發現用siRNA技術以Livin為靶點治療腫瘤的可行性。IAPs家族是抑制細胞凋亡的重要蛋白之一，Livin作為該家族的新成員，特異性高表達于多種人類惡性腫瘤中，對其深入研究對腫瘤的發生、發展和治療、預防都有重要意義，而目前對于Livin在卵巢上皮性癌中的研究有限，尚需進一步加深研究。

參考文獻：

[1]蔡 明,王國斌,陶凱雄等.Livin靶向siRNA對大腸癌細胞凋亡的誘導作用[J].中華腫瘤防治雜志,2010,17(12):890.

[2]Crnkovic-Mertens I,Bulkescher J,Mensger C,et al.Isolation of peptides blocking the function of anti-apoptotic livin protein[J].Cell Mol Life Sci，2010,67(11):1895.

[3]Liu Chuan,Wu Xiaohou,Luo Chunli，et al.Antisense oligonucleotide targeting Livin induces apoptosis of human bladder cancer cell via a mechanism involving capase3[J].J Exp Clin Cancer Res.2010,29(3):63.

[4]Li Wen-Qi,Li Xiao-Lin,Wang Guang-Ping，et al.Gene expression of livin and surviving in adult patients with acute lymphoblastic lerkemia and its clinical significance[J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi.2011,19(4):921.

[5]程永貴,封韜,王曉慶.Livin蛋白在腎細胞癌中的表達及其與預后的關系[J].腫瘤學雜,2012,18(3):217.

[6]Yagihashi A,Asanuma K,Tsuji N,et al.Detection of anti-Livin anti-body in gastrointestinal cancer patients[J].Clin Chem,2003,49(7):1206.

[7]Tanabe H,Yagihashi A,Tsuji N,et al.Exp ression of survivin mRNA and livin mRNA in non-small cell lung cancer[J].Lung Cancer,2004,46(3):299.

[8]Vucic D,Stennicke HR,Pisabarro MT,et al.ML-IAP,a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expre- ssed in human melanomas[J].Curr Biol,2000,10(11):1359.

[9]Yagihashi A,Asanuma K.Nakamura M,et al.Detection of anti-survivin antibody in Gastrointestinal cancer patients[J]．Clin Chem,2001,47;1729.

[10]Gazzaniga P,Gradilone A,Giuliani L,et al.Expression and prognostic significance of livin,survivin and other apoptosis related genes in the progression of superficial bladder cancer [J].Ann Oncol,2003,14(1):85.

[11]Kasof GM,Gomes BC.Livin,a novel inhibitor of apoptosis protein family member [J].J Biological Chemistry,2001,276(5):3238.

[12]Mertens IC,Seyler FH,Butz K.Induction of apoptosis in tumor cells by siRNA-mediated silencing of the Livin/ ML-IAP/KIAP gene[J].Oncogene,2004(22):8330.