油脂中茶多酚的分析方法研究

紀(jì)姝晶等

摘要：對(duì)油脂中茶多酚進(jìn)行了測(cè)定。采用硅膠固相萃取凈化、經(jīng)皂化處理并結(jié)合福林酚比色法進(jìn)行定量測(cè)定。考察了影響固相萃取的因素，分別對(duì)清洗溶劑以及解吸溶劑進(jìn)行了考察，并對(duì)去除油脂效果和茶多酚的回收率進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，最佳方案為使用6 mL石油醚洗去油脂，15 mL酸性甲醇（0.2%甲酸）洗脫茶多酚。

關(guān)鍵詞：茶多酚；固相萃取；皂化；福林酚比色

中圖分類號(hào)：TS227 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）13-3159-04

Determination of Tea Polyphenols in Oil

JI Shu-jing1，WANG Yang1，MAO Wen-yue2，WANG Shan-shan3，CUI Tong1

（1.College of Sciences， Hebei Agricultural University， Baoding 071001， Hebei， China 2.Heze Peony Technology Co.， Ltd， Heze 274000， Shandong， China； 3.Laiyang Luhua Group Co.， Ltd， Laiyang 265200， Shandong， China）

Abstract： Tea polyphenols（TP） in oil were determined. Solid extraction column of silica was used to clean the TP，which was saponified with an alkali and determined by Folin colorimetric method. The results showed that 6 mL petroleum ether could remove the oil impurity and 15 mL methanol containing 0.2% formic acid could recover the TP.

Key words： tea polyphenols； solid phase extraction； saponification； Folin colorimetric method

茶多酚（TP）又稱茶單寧、茶鞣質(zhì)，是一種羥基酚類化合物，是茶葉中酚類及其衍生物的總稱。其可分為黃烷醇類、羥基-[4]-黃烷醇類、花色苷類、黃酮類、黃酮醇類和酚酸類等，其中以兒茶素最多，占多酚類總量的60%～80%。研究表明，茶多酚具有抗氧化[1]、防輻射[2]、抗衰老[3]、降血脂、降血糖、抑菌抑酶[4]等多種生理活性，抗氧化活性強(qiáng)，且安全無(wú)毒，是良好的天然抗氧化劑。茶多酚是由水溶性茶多酚與棕櫚酰氯合成的棕櫚酸黃烷醇酯類化合物，易溶于油脂，具有優(yōu)異的抗氧化效果[5，6]和食用安全性[7，8]，是替代合成抗氧化劑的優(yōu)質(zhì)材料，已經(jīng)被國(guó)家有關(guān)部門批準(zhǔn)在食用油等相關(guān)產(chǎn)品中使用。然而由于上述產(chǎn)品化學(xué)成分比較復(fù)雜，目前尚未建立一套準(zhǔn)確可靠的定量分析方法，因而制約了其在油脂等相關(guān)產(chǎn)品中的應(yīng)用。

目前有關(guān)茶多酚測(cè)定的報(bào)道主要涉及茶葉中天然水溶性茶多酚的測(cè)定。如GB/T 8313-2002《茶 茶多酚測(cè)定》[9]和GB/T 8313-2008[10]。黃皓等[11]研究表明，GB/T 8313-2008相對(duì)于GB/T 8313-2002 測(cè)定茶多酚含量所需試劑消耗量小、提取充分、操作便捷、靈敏度高、精密度好。而茶多酚的化學(xué)成分比較復(fù)雜，關(guān)于其分析方法至今國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。因此有必要建立一套準(zhǔn)確可靠的定量分析方法，以擴(kuò)大其在油脂等相關(guān)產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本研究采用硅膠固相萃取凈化技術(shù)、皂化處理、并結(jié)合福林酚比色法建立了一種食用油中茶多酚定量分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食用油由山東魯花集團(tuán)有限公司提供。硅膠固相萃取柱（1 000 mg/6 mL，30 pk月旭材料科技有限公司）。茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品均由山東魯花集團(tuán)提供。福林酚（分析純，上海荔達(dá)生物科技有限公司）。石油醚、甲醇、甲酸、氫氧化鉀、鹽酸、碳酸鈉均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；101-0AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津泰斯特有限公司）；TB-215D型十萬(wàn)分之一分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SP-756P型紫外可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪儀器廠）；固相萃取裝置（美瑞泰克科技有限公司）；800A型離心機(jī)（常州國(guó)華電器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 硅膠固相萃取小柱的預(yù)處理 將15 mL酸性甲醇（0.2%甲酸）上柱，清洗硅膠固相萃取小柱（柱體積為3 mL），待甲醇全部流出后，將小柱置于電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，于100 ℃干燥30 min后升溫至105 ℃干燥3 h，活化硅膠固相萃取小柱。

1.3.2 油脂中茶多酚的固相萃取 準(zhǔn)確稱取油脂樣品5.0 g，溶于5.0 mL石油醚中，混勻后上樣于硅膠固相萃取小柱，控制流速1滴/2～3 s。待樣品滴完后，加入6 mL石油醚去除油脂，再加入15 mL酸性甲醇（0.2%甲酸）解吸茶多酚，收集解吸液至蒸餾燒瓶?jī)?nèi)。

1.3.3 茶多酚的皂化 將蒸餾燒瓶?jī)?nèi)的甲醇減壓蒸干，用10.0 mL乙醚轉(zhuǎn)溶，轉(zhuǎn)移至60 mL分液漏斗中，加入5.0 mL 2%的氫氧化鉀溶液進(jìn)行皂化萃取，20 min后取下層溶液，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH至6～7，再用0.5%的氫氧化鉀溶液萃取2次，每次20 min，取下層，調(diào)節(jié)pH 6～7，合并萃取相，加水定容至25 mL容量瓶中。

1.3.4 茶多酚的測(cè)定 移取2.0 mL的皂化萃取液于比色管中，加入10%的福林酚溶液5.0 mL，搖勻后于3～8 min之內(nèi)加入7.5%的碳酸鈉溶液3.0 mL，顯色1 h（顯色后若出現(xiàn)白色渾濁必須離心）后在765 nm下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

1.3.5 色譜分析條件 色譜柱為Kromasil硅膠色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)，306 nm；流速，0.8 mL/min；柱溫，35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。圖1使用的流動(dòng)相，石油醚∶乙酸乙酯=9∶1（V/V），圖2使用的流動(dòng)相，石油醚∶乙酸乙酯=7∶3（V/V）。

2 結(jié)果與分析

茶多酚是一種混合物，組成比較復(fù)雜，不適于HPLC法測(cè)定其總含量。采用經(jīng)過(guò)酸性甲醇溶液活化的硅膠柱對(duì)油脂樣品中茶多酚進(jìn)行富集，使用石油醚去除油脂，再用極性較強(qiáng)的洗脫劑進(jìn)行洗脫，最后進(jìn)行測(cè)定。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道[12-17]茶葉中的水溶性茶多酚含量分析的方法，但它不適于直接用于茶多酚的分析，因此要進(jìn)行皂化反應(yīng)，將茶多酚轉(zhuǎn)化為水溶性茶多酚，再測(cè)定其總含量。

2.1 溶劑的選擇

圖1為流動(dòng)相為石油醚∶乙酸乙酯（9∶1，V/V）茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖；圖2為流動(dòng)相石油醚∶乙酸乙酯（7∶3，V/V）茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖。當(dāng)流動(dòng)相為石油醚∶乙酸乙酯（9∶1，V/V）時(shí)，茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品正相色譜圖在30 min內(nèi)基本無(wú)峰，說(shuō)明茶多酚吸附在正相柱上幾乎未被洗脫；而改變流動(dòng)相，增強(qiáng)它的極性，變?yōu)槭兔选靡宜嵋阴ィ?∶3，V/V）時(shí)，茶多酚正相色譜圖在2～15 min出峰，說(shuō)明茶多酚大部分被洗脫下來(lái)。為了確保更高的回收率，固相萃取時(shí)選用用極性較弱的洗脫溶劑去除油脂和脂溶性雜質(zhì)，用極性較強(qiáng)進(jìn)行解吸，實(shí)現(xiàn)了茶多酚與脂溶性的雜質(zhì)分離。

2.2 石油醚洗脫去除油脂的效果

準(zhǔn)確稱取油脂樣品5.0 g，溶于5.0 mL石油醚中，混勻后上樣于硅膠固相萃取小柱，控制流速1 滴/2～3 s，將上樣流出液收集于試管中。依次加入3 mL石油醚去除油脂，每份柱體積洗脫液分別接收至不同試管中，揮干石油醚后稱重。不同體積的石油醚去除油脂的效果如圖3所示。

從圖3可以看出，石油醚的體積越大，除去油脂的效果越好，當(dāng)洗脫體積為6 mL時(shí)，石油醚對(duì)油脂的去除率達(dá)到95.2%，且隨著洗脫體積的增加，石油醚除去油脂的量變化不大，所以本試驗(yàn)石油醚洗脫體積確定為6 mL。

2.3 石油醚洗脫對(duì)茶多酚造成的損失

石油醚盡管是極性很弱的洗脫溶劑，但是在去除油脂的同時(shí)，仍會(huì)帶走一定量的茶多酚，對(duì)茶多酚測(cè)定造成一定的影響。將5.0 mL濃度為0.1 mg/mL的茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液，上樣于活化好的硅膠固相萃取柱，依次加入3 mL石油醚，每倍柱體積分別接收至不同試管中，定容至5 mL，于765 nm下測(cè)定吸光度，根據(jù)各管吸光度值占上樣液吸光度的百分比，計(jì)算損失情況，圖4為不同體積的石油醚洗脫油脂時(shí)對(duì)茶多酚的損失率。

從圖4可以看出，石油醚洗脫體積越大，帶走的茶多酚越多，損失越大，當(dāng)洗脫體積為6 mL時(shí)，茶多酚損失率為7%。

2.4 酸性甲醇回收茶多酚效果

將5.0 mL濃度為0.1 mg/mL的茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液，上樣于活化好的硅膠固相萃取柱，加入6 mL石油醚去除油脂，再依次加入3 mL酸性甲醇解吸茶多酚，每個(gè)柱體積解吸液分別接收至不同試管中，揮干甲醇后，用石油醚定容至5 mL，于756 nm下測(cè)定吸光度，根據(jù)各管吸光度值占上樣液吸光度的百分比，計(jì)算回收效果，如圖5所示，酸性甲醇洗脫體積越大，茶多酚的解吸越徹底，為了提高解吸效率，采用15 mL的酸性甲醇洗脫，茶多酚解吸率為97.4%。

2.5 油脂樣品中未被石油醚除去的油脂對(duì)茶多酚測(cè)定的影響

在茶多酚的固相萃取步驟中，采用6 mL的石油醚洗脫，只能去除約95%的油脂，剩余的部分是油脂中天然存在的一些極性成分，它們不能被弱極性的石油醚洗脫除去，卻會(huì)被極性更強(qiáng)的酸性甲醇解吸下來(lái)，經(jīng)過(guò)皂化，顯色測(cè)定，產(chǎn)生吸光度，對(duì)茶多酚的定量產(chǎn)生影響。為了測(cè)定這些成分的影響，使用空白油樣，按照本試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖6所示。

從圖6中可以看出，隨酸性甲醇的洗脫回收體積增大，被回收的極性成分越多，產(chǎn)生的吸光度越大，使用15 mL的酸性甲醇回收時(shí)，雜質(zhì)的吸光度是0.293，將作為本底被扣除。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用石油醚將茶多酚的標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度（mg/mL）分別為0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照“2.2”所述方法，經(jīng)過(guò)硅膠柱對(duì)油脂樣品中茶多酚進(jìn)行富集，用石油醚去除油脂，再用酸性甲醇解吸茶多酚，然后用氫氧化鉀溶液皂化，福林酚比色法測(cè)定茶多酚的含量，然后以吸光度為縱坐標(biāo)，茶多酚的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如下：標(biāo)準(zhǔn)回歸方程：y=0.000 7x-0.038 1（R2=0.956 6）。

2.7 重現(xiàn)性和回收率試驗(yàn)

將質(zhì)量濃度為0.100、0.200 mg/mL的茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品加入空白樣品油中，按照試驗(yàn)方法測(cè)定3次，計(jì)算該方法的重現(xiàn)性及回收率，結(jié)果如表1所示。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)初步探索了茶多酚的分析方法。采用硅膠固相萃取分離茶多酚，用6 mL石油醚去除油脂，15 mL酸性甲醇（0.2%甲酸）解吸茶多酚，經(jīng)氫氧化鉀皂化。最后采用福林酚比色法，于765 nm下測(cè)定吸光度，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，計(jì)算出茶多酚的含量。

本方法操作簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜分析儀器，分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以作為食用油中茶多酚總含量分析的常規(guī)檢測(cè)方法，為其質(zhì)量監(jiān)控提供了檢測(cè)手段，以上這些分析結(jié)果為茶多酚在油脂中的開發(fā)利用提供了新的科學(xué)根據(jù)。

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