缺血后適應對心肌缺血再灌注兔超氧化物歧化酶酶蛋白活力濃度、丙二醛濃度的影響

李方江 張文婷 王曉元

·論著·

缺血后適應對心肌缺血再灌注兔超氧化物歧化酶酶蛋白活力濃度、丙二醛濃度的影響

李方江 張文婷 王曉元

目的觀察缺血后適應對心肌缺血再灌注兔丙二醛(manlondialdehyde，MDA)濃度、超氧化物歧化酶(superoside dismutase，SOD)酶蛋白活力濃度的影響。方法24只日本大耳白兔隨機分為3組(n=8)，采用結扎兔左冠狀動脈前降支30 min、復灌120 min建立心肌缺血再灌注模型。假手術組：動脈下僅穿線不結扎；缺血再灌注組：直接恢復再灌注；缺血后適應組：缺血后30 min即刻給予3輪復灌30 s/缺血30 s作為后適應，再灌注120 min。檢測3組MDA濃度、SOD酶蛋白活力濃度。結果缺血再灌注組較假手術組外周血MDA濃度明顯升高(P<0.01)，SOD酶蛋白活力濃度明顯降低(P<0.01)；缺血后適應組較缺血再灌注組外周血MDA濃度明顯降低(P<0.01)，SOD酶蛋白活力濃度明顯升高(P<0.01)。結論心肌缺血再灌注可導致兔外周血MDA濃度升高，SOD酶蛋白活力濃度降低；缺血后適應可顯著降低心肌缺血再灌注兔外周血MDA濃度，提高SOD酶蛋白活力濃度，具有減輕心肌缺血再灌注損傷的作用。

缺血后適應；心肌缺血再灌注損傷；超氧化物歧化酶；丙二醛

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia and reperfusion injury，MIRI)是指缺血心肌在恢復血流引起大量自由基生成、能量代謝障礙、鈣離子超負荷等，從而導致心肌超微結構、電生理、功能及代謝的進一步損害。這種再灌注損傷可導致心肌和微血管功能頓抑、心律失常及心肌壞死，嚴重影響缺血后心臟功能的恢復，危及患者生命。缺血后適應(ischemic post conditioning，IPOC)是指在缺血損傷后的心肌恢復血流再灌注后立即給予數次短暫的缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)后處理，能提高心肌對之前較長時間I/R的耐受性，從而減輕MIRI[1，2]。本研究探討IPOC對兔心肌缺血再灌注心肌外周血丙二醛(MDA)濃度、超氧化物歧化酶(SOD)酶蛋白活力濃度的影響，報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

1.1.1 實驗動物：健康日本大耳白兔24只，體重2.0～3.5 kg。雌雄各12只，由河北北方學院動物實驗中心提供。用前適應性喂養1周。

1.1.2 主要藥品及試劑：烏拉坦(北京篤信精細制劑廠)；96孔板超氧化物歧化酶(superoside dismutase，SOD)測定試劑盒、96孔板丙二醛(manlondialdehyde，MDA)測定試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)。

1.1.3 儀器：LEAD-2000多道電生理記錄儀(四川錦江電子科技有限公司)；動物呼吸機(上TOPO， 美國Kent公司)；Rayto酶標儀(RT-2100C，美國Rayto公司)；中佳中低速臺式離心機(KDC-40,浙江科大創新股份有限公司中佳分公司)；恒溫水浴箱(美國Thermo公司)；醫用DW-86W420低溫冷凍冰箱(-86℃，山東海爾)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備：分離兔耳緣靜脈，經兔耳緣靜脈注射20%烏拉坦5 ml/kg，麻醉后固定于實驗臺。四肢及胸前皮下置入電極，連接LEAD-2000多道電生理記錄儀，監測心電圖變化。經兔耳緣靜脈建立液體通路，林格氏液300 ml以5 ml·kg-1·h-1靜脈滴注補液。頸部正中皮膚備皮、消毒，經氣管行T字型切開后插管，接動物呼吸機進行機械控制呼吸，頻率控制在45次/min，氧流量保持在0.8 L/min。分離右頸總動脈，將24號靜脈留置針一端置入右頸總動脈內結扎固定，另一端通過壓力換能器連接LEAD-2000多道電生理記錄儀監測實驗全程血壓及心電圖變化。胸部備皮、消毒。沿胸骨左緣3～4肋間隙作切口開胸，逐層分離進入胸腔，暴露心臟，切開心包，同時取少量心包組織作為縫線墊片。撥開左心耳可見左冠狀動脈自主動脈根部發出，確認左冠狀動脈前降支(left anteriordescending coronary artery，LAD)即沿左心室間溝下行的動脈分支，在LAD根部穿雙股2-0絲線，線兩端各穿一縫線墊片(防止結扎時割裂心肌)，結扎其中一股造成心肌梗死，復灌時剪斷此線；另一股絲線穿縫線墊片后兩端并攏套一自制的細塑料管，在行缺血后處理時拉緊該細塑料管造成缺血，放松則恢復灌注(推管法)。建模成功標準：結扎絲線后，心電圖胸導聯ST段出現弓背向上抬高、T波高聳等表現，為缺血成功；剪斷絲線后，抬高的ST段下降，為復灌成功。

1.2.2 實驗動物分組與處理：采用分離LAD，結扎30 min、復灌120 min的方法建立心肌I/R模型。24只健康日本大耳白兔分為：①假手術組(sham-operated group，S組，n=8)：僅開胸并分離LAD，但不阻斷血流；②缺血再灌注組(I/R組，n=8)：結扎LAD 30 min后，復灌120 min；③缺血后適應組(IPOC組，n=8)：結扎LAD 30 min后，即刻復灌，給予3輪復灌30 s/缺血30 s作為后處理，復灌120 min。

1.3 監測指標 MDA濃度及SOD酶蛋白活力濃度：于再灌注結束即刻頸動脈抽取動脈血1 ml，以4 500 r/min分離血清，-80℃冰箱保存，解凍后MDA濃度以硫代巴比妥酸鹽(thiobarbituricacid，TBA)法用MDA測定試劑盒測定，SOD酶蛋白活力濃度以黃嘌呤氧化酶法用SOD測定試劑盒測定。

2 結果

與S組比較，I/R組、IPOC組的MDA濃度顯著升高(P<0.01)；與I/R組比較，IPOC組MDA濃度明顯降低(P<0.01)。與S組比較，I/R組、IPOC組的SOD酶蛋白活力濃度顯著降低(P<0.01)；與I/R組比較，IPOC組SOD酶蛋白活力濃度明顯升高(P<0.01)。見表1。

組別SOD(U/ml)MDA(nmol/ml)S組226．75±20．842．13±0．47I/R組81．63±20．84?6．28±0．59?IPOC組130．18±20．44?#4．42±0．47?#

注：與S組比較，*P<0.01；與I/R組比較，#P<0.01

3 討論

IPOC是Zhao等[1]2003年首次系統闡述了的概念，即在缺血損傷的心肌在恢復血流再灌注后立即重復數次予以短暫的I/R處理，能提高心肌對之前較長時間I/R的耐受性，從而減輕I/R損傷，稱之為IPOC。該研究建立狗的心肌I/R的模型，發現與未進行IPOC處理的對照組比較，I/R組的心律失常的發生率亦明顯減低，心肌梗死面積、細胞凋亡明顯減少，心肌細胞的炎性反應明顯減輕。該實驗分析IPOC可能通過減少氧自由基生成、抑制中性粒細胞活化、調節再灌注早期冠狀動脈動力學狀態從而減輕水腫和防止血管內皮損傷，達到保護心肌的作用。隨后大量的動物實驗及小樣本臨床研究證實其具有臨床可控性及臨床應用價值[3-5]。

MIRI時線粒體功能受損導致氧自由基(OFR)的清除減少，氧自由基通過與生物膜磷脂中的多價不飽和脂肪酸發生反應，引發鏈式脂質過氧化物反應，形成以MDA為代表的一系列脂質過氧化產物，最終導致心肌細胞膜、其他基質功能的過氧化損害[6，7]。MDA作為血清代謝指標可間接反映心肌細胞損傷的嚴重程度。SOD是體內的主要抗氧化酶，可通過清除氧自由基，保護細胞免受自由基的損傷[8]。實驗中通過SOD和MDA的檢測可以對缺血再灌注的損傷和后處理方式的抗氧化作用進行評價，進而反映后處理的心肌保護作用[9，10]。

本試驗結果表明：所有試驗組與S組比較MDA濃度顯著升高(P<0.01)；IPOC組較I/R組MDA濃度明顯降低(P<0.01)。所有試驗組與S組比較SOD酶蛋白活力濃度顯著降低(P<0.01)；IPOC組較I/R組SOD酶蛋白活力濃度明顯升高(P<0.01)。其中IPOC對心肌缺血再灌注的保護可能：(1)減少氧自由基生成和抑制中性粒細胞活化；(2)調節再灌注早期冠狀動脈動力學狀態從而減輕水腫和防止血管內皮損傷，達到保護心肌的作用[1，4]。

本試驗表明心肌缺血再灌注損傷可致兔外周血MDA濃度升高，SOD酶蛋白活力濃度降低，缺血后適應顯著降低心肌缺血再灌注兔外周血MDA濃度、提高SOD酶蛋白活力濃度，具有減輕心肌缺血再灌注損傷的作用。

1 Zhao ZQ,Corvera JS,Halkos ME,et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion comparison with ischemic preconditioning.Physiol Heart Circ Physiol,2003,285:579-588.

2 吳燁,何玲.心肌缺血再灌注損傷的機制研究進展及相關藥物的研發.藥學進展,2010,7:305-311.

3 田濤,馬賓,王明霞，等.缺血后處理對減輕兔心肌缺血再灌注損傷作用的研究.中華全科醫學,2012,10:170-176.

4 Laskey WK.Brief repetitive balloon occlusions enhance reperfusion during percutaneous coronary intervention for acute myocardial infarction:a pilot study.Cardiovasc Interv,2005,65: 361-367.

5 Staat P,Rioufol G,Piot C,et al.Postconditioning the human heart.Circulation,2005,112: 2143-2148.

6 Lee WH,Gounarides JS,Roos ES,et al.Influence of peroxynitrite on energy metabolism and cardiac function in a rat ischemia-reperfusion model.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003,285: H1385-H1395.

7 趙旭,范英昌,杜云.丹酚酸 B 對局灶性腦缺血/再灌注大鼠血清超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量的影響.天津中醫藥,2008,25:63-65.

8 Machlin LJ,Bendich A.Free radical tissue damage: protective role of antioxidant nutrients.The FASEB Journal,1987,1:441-445.

9 于月新,李巨,鄭莉彥,等.缺血再灌注損傷對家兔超氧化物歧化酶、丙二醛、誘導型一氧化氮合酶水平影響的研究.婦產與遺傳,2012,3:31-471.

10 沈繼龍,朱克軍,顧紅軍,等.大鼠心肌缺血再灌注損傷不同時相氧化應激相關指標的變化.臨床和實驗醫學雜志,2013,3:177-178.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.21.024

張家口市科技局指令性科研課題(編號：12110044D-2)

075000 河北省張家口市，河北北方學院第一附屬醫院心血管內科(李方江)；河北北方學院研究生部(張文婷、王曉元)

R 542.2

A

1002-7386(2014)21-3265-03

2014-03-11)