腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白對佐劑性關節炎大鼠滑膜中TNF-α、TGF-β1和VEGF表達的影響

郭立霞 徐育冬 王浩 朱明華

·論著·

腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白對佐劑性關節炎大鼠滑膜中TNF-α、TGF-β1和VEGF表達的影響

郭立霞 徐育冬 王浩 朱明華

目的探討腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白對佐劑性關節炎大鼠滑膜中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉化生長因子-β1 (TGF-β1)血管內皮生長因子(VEGF)表達的影響。方法將成年雄性Wistar大鼠隨機分為5組，Ⅱ～Ⅴ組建立佐劑性關節炎大鼠(AA)模型，于造模后第12天開始Ⅲ組給予甲氨喋呤灌胃治療，Ⅳ～Ⅴ組給予益賽普皮下注射治療。第28天取膝關節滑膜，常規HE染色，計算滑膜病理積分，免疫組織化學染色檢測TNF-α、TGF-β1和VEGF在膝關節滑膜的表達。結果正常對照組大鼠滑膜組織均有少量TNF-α、TGF-β1和VEGF的表達，Ⅱ～Ⅴ組較Ⅰ組均明顯增高(P<0.05)。Ⅳ、Ⅴ組滑膜組織TNF-α表達較Ⅱ組明顯減低(P<0.05)，而Ⅲ組與Ⅱ組無統計學意義(P>0.05)。Ⅲ～Ⅴ組滑膜組織TGF-β1、VEGF的表達均明顯低于Ⅱ組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論可溶性重組人腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白可明顯降低AA大鼠滑膜組織TNF-α、TGF-β1和VEGF表達，對AA大鼠的關節炎癥有明顯的治療作用，可能抑制局部組織血管新生。

佐劑性關節炎大鼠；可溶性重組人腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白(益賽普)；腫瘤壞死因子-α；轉化生長因子-β1；血管內皮生長因子

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性進行性自身免疫性疾病，以關節滑膜炎，對稱性和破壞性關節病變為主要特征。血管新生促進滑膜血管翳的發生和發展，維持血管翳的侵襲性，促進軟骨和骨破壞及關節重塑，最終造成關節畸形、強直和功能喪失。TGF-β屬于生長因子超家族，具有調節創傷愈合、成纖維細胞增生和血管新生等功能，VEGF是促進血管新生的關鍵因子，可能在RA發病機制中起重要作用。在細胞因子相互作用的網絡中TNF-α居于中心位置，是RA滑膜炎發生和持續的一個關鍵性因子[1]。益賽普(腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白)是一種拮抗TNF-α的生物制劑，目前已應用于臨床，治療效果優于傳統的抗風濕藥。但國內對于益賽普能否抑制促進血管增生的細胞因子TGF-β1、VEGF分泌罕有報道。本試驗以佐劑誘導的關節炎大鼠模型為基礎，觀察益賽普對關節炎的影響，評價其療效，探討益賽普治療RA的機制、臨床應用價值及其對滑膜組織血管增生的抑制情況。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 動物 Wistar大鼠90只，雄性，體重140～160 g，由河北省實驗動物中心提供，合格證號 802120，許可證號SCXK(冀) 2003-1-003。完全弗氏佐劑(FCA，10 ml)購于Sigma公司，卡介苗(BCG，50 mg/支) 購自華瑞創新生物科技開發中心。TNF-α免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物制品公司，TGF-β1、VEGF免疫組化成套試劑盒購自晶美生物制品公司。

1.2 分組及AA大鼠模型的建立 將90只雄性Wistar大鼠采用數字表法隨機分為5組，分別編號Ⅰ～Ⅴ組，Ⅰ組10只，Ⅱ～Ⅴ組，每組20只。Ⅰ組為正常對照組，Ⅱ組為單純造模組，Ⅲ組為造模+甲氨喋呤組，Ⅳ組為造模+益賽普低劑量組(0.44 mg/kg)，Ⅴ組為造模+益賽普高劑量組(0.88 mg/kg)。將FCA與卡介苗配置為含BCG 10 mg/ml 的水包油乳劑。試驗第一天在第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組大鼠的尾根部皮內注射該乳劑0.2 ml致炎，誘發佐劑性關節炎。而正常對照組大鼠的尾根部皮內注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.3 給藥 于致炎后第12～23天Ⅳ、Ⅴ組皮下注射益賽普，Ⅳ組予以益賽普0.44 mg·kg-1·d-1，Ⅴ組予以益賽普0.88 mg·kg-1·d-1。給藥容積均為0.1 ml/100 g，連續12 d。Ⅲ組大鼠給予甲氨喋呤2.7 mg·kg-1·周-1灌胃，Ⅱ組大鼠蒸餾水灌胃0.5 ml·只-1·d-1；給藥時間均固定在每天上午9∶00。

1.4 病理學及免疫組織化學檢測 于致炎后第28天，處死所有大鼠并取膝關節滑膜組織，置于4%多聚甲醛固定液中固定，以備作病理及免疫組織化學檢測。常規HE染色并計算滑膜病理積分，按照程度不同分別評分[2]：0分：正常；1 分：極少炎性細胞浸潤或(和)組織輕微水腫；2分：輕微浸潤；3分：中等浸潤；4分：明顯浸潤；5分：嚴重浸潤。免疫組化檢測用SABC (鏈霉親和素生物素酶復合物)法，TNF-α、TGF-β1和VEGF陽性滑膜細胞均呈顆粒狀棕黃色或棕褐色。采用真彩色圖像分析系統對TNF-α、TGF-β1和VEGF表達強度進行定量分析。方法[3]如下：每張切片隨機選取5個視野(×200)，系統自動測量出陽性染色部位的積分光密度(IOD)，5個視野的平均IOD值代表該切片TNF-α、TGF-β1和VEGF的表達情況。

1.5 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，采用單因素方差分析，相關性采用直線相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 第Ⅱ～Ⅴ組大鼠造模后共有38只于第15～19天先后出現關節紅、腫等關節炎表現，給藥期間第Ⅱ組死亡1只，Ⅲ、Ⅳ組各有1只受傷，剔出死亡、受傷及造模不成功的大鼠后，最終入選實驗統計結果的實驗動物共計45只，Ⅰ、Ⅱ組各10只，Ⅲ、Ⅳ組各9只，Ⅴ組7只。

2.2 大鼠滑膜病理學改變及病理學評分 正常大鼠滑膜襯里層有1～2層滑膜細胞組成，且部分不連續。滑膜襯里層下層為由脂肪細胞、少量成纖維細胞、巨噬細胞和少量血管組成的結締組織。滑膜組織無炎性細胞浸潤，無纖維組織增生。單純造模組可見滑膜組織中等量淋巴細胞、單核細胞及中性粒細胞浸潤，平均病理積分3.8±0.45，滑膜襯里層增生達4～6層。Ⅲ～Ⅴ組滑膜組織病理積分均明顯低于Ⅱ組，并具有統計學差異(P<0.01)；Ⅴ組滑膜組織病理積分低于Ⅲ組，且有統計學差異；Ⅳ組滑膜組織病理積分與Ⅲ、Ⅴ組之間無統計學差異(P>0.05)。見表3。

表3 大鼠膝關節滑膜病理學積分

表3 大鼠膝關節滑膜病理學積分

組別分數Ⅰ組(n=10)0Ⅱ組(n=10)3.8±0.4Ⅲ組(n=9)2.8±0.8*Ⅳ組(n=9)2.4±0.6#Ⅴ組(n=7)2.0±0.7#

注：與Ⅱ組比較，*P<0.05，#P<0.01

2.3 滑膜組織TNF-α、TGF-β1和VEGF的表達 正常對照組大鼠滑膜組織均有少量TNF-α、TGF-β1和VEGF的表達。與Ⅰ組相比：Ⅱ～Ⅴ組均明顯增高，有統計學意義(P<0.01)。與Ⅱ組相比：Ⅳ、Ⅴ組滑膜組織TNF-α表達較Ⅱ組明顯減低，有統計學意義(P<0.01)；Ⅲ組TNF-α表達雖低于Ⅱ組，但無統計學意義。Ⅲ～Ⅴ組滑膜組織TGF-β1、VEGF的表達均明顯低于Ⅱ組且有統計學意義(P<0.01)。Ⅳ、Ⅴ組滑膜組織TNF-α表達低于Ⅲ組，有統計學意義(P<0.05)，Ⅴ組滑膜組織TNF-α表達低于Ⅳ且有統計學意義(P<0.05)。Ⅲ、Ⅳ組滑膜組織TGF-β1、VEGF的表達均高于Ⅴ組，有統計學意義(P<0.05)；Ⅲ與Ⅳ組之間無統計學意義(P>0.05)。見表4，圖1～8。

表4 大鼠膝關節滑膜組織TNF-α、TGF-β1和VEGF的IOD值

組別TNF-αTGF-β1VEGFⅠ組237±48183±28193±14Ⅱ組1105±186#1020±230#1030±248#Ⅲ組1053±129# 733±125#△ 668±129#☆Ⅳ組 835±109#☆ 709±118#☆ 641±108#☆Ⅴ組 661±84#☆ 499±99#☆ 440±62*☆

注：與Ⅰ組比較，*P<0.05，#P<0.01;與Ⅱ組比較，△P<0.05，☆P<0.01

3 討論

益賽普(Etanercept)即注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白，是一種可抑制TNF-α功能的生物制劑。目前益賽普抗炎療效的可能的機制包括：(1)減少炎癥部位的細胞生成；(2)下調滑膜細胞因子的表達；(3)降低血漿MMP-1和MMP-3的水平；(4)可調節細胞的凋亡[4]。許多研究結果顯示，應用益賽普治療的RA患者關節炎癥明顯好轉。TGF-β1和VEGF在血管新生的病理和生理中炎癥具有重要作用。有研究認為TGF-β1誘導滑膜血管增生是通過刺激滑膜細胞分泌VEGF來實現的。RA滑膜組織中TGF-β1表達增多，調節FGF從而影響血管新生和滑膜細胞增殖。研究顯示，在體內TNF-α啟動VEGF生成以促進血管新生，抗TNF-α治療可降低VEGF生成及與RA相關的血管新生，使增生血管復原[5，6]。抗TNF-α制劑，在體外培養的滑膜細胞可抑制VEGF生成[7]。本試驗顯示，益賽普可抑制滑膜組織TNF-α、TGF-β1和VEGF的過度表達。益賽普治療組滑膜組織TNF-α的表達低于單純造模組，而甲氨喋呤組與單純造模組無統計學差異，說明益賽普可降低滑膜組織TNF-α的表達。益賽普治療組滑膜組織TGF-β1、VEGF的表達均明顯低于單純造模組，高劑量組明顯低于甲氨喋呤組，而低劑量組與甲氨喋呤組無統計學差異(P>0.05)。說明益賽普可以降低AA大鼠滑膜組織TGF-β1、VEGF的表達，抑制新生血管形成，從而減少血管翳的形成。益賽普治療組大鼠滑膜組織病理積分均明顯低于單純造模組；高劑量組明顯低于甲氨喋呤組，而低劑量組與甲氨喋呤組無統計學意義。說明益賽普可以有效抑制或延緩AA大鼠關節病理改變，減輕關節病變程度且成劑量依賴性。與甲氨喋呤治療組比較，益賽普高劑量組在TNF-α、TGF-β1和VEGF在滑膜的表達、滑膜病理積分均明顯降低，而低劑量組與甲氨喋呤組無統計學差異，說明益賽普起效早于甲氨喋呤，近期效果優于甲氨喋呤，這可能與給藥方法不同，以及甲氨喋呤起效緩慢有關，但遠期療效尚有待觀察。本試驗說明：經益賽普治療的AA大鼠，從滑膜TNF-α、TGF-β1和VEGF水平、滑膜病理積分幾方面均顯著低于未經治療的AA大鼠，近期療效優于甲氨喋呤，其機制可能與益賽普中和TNF-α，抑制了TNF-α促炎因子的作用，從而間接抑制了對血管翳形成直接造成軟骨和骨破壞起主要作用的TGF-β1、VEGF的表達有關。益賽普作為一種新興的生物制劑，對于傳統的抗風濕藥而言，尤其是對傳統抗風濕藥物禁忌、耐藥和毒副作用較為嚴重的RA患者，可作為新一類的治療藥物以供臨床選擇。

圖1 正常滑膜組織(×400)

圖2 佐劑關節炎大鼠膝關節骨膜(HE) (×400)

圖3 TNF-α在正常滑膜組織的表達(×400)

圖4 TNF-α在佐劑關節炎大鼠膝關節滑膜的表達(×400)

圖5 VEGF在正常滑膜組織的表達(×400)

圖6 VEGF在佐劑關節炎大鼠膝關節滑膜的表達(×400)

圖7 TGF-β1在正常滑膜組織的表達(×400)

圖8 TGF-β1 在佐劑關節炎大鼠膝關節滑膜的表達(×400)

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Effect of rhu-TNFR-Fc on the expression of TNF-α,TGF-β1 and VEGF in synovium of rats with adjuvant arthritis

GUOLiXia,XUYuDong,WANGHao,etal.DepartmentofUrology,GeneralHospitalofNorthernChinaPetroleumAdministrationBureau,Hebei,Renqiu062552,China

ObjectiveTo investigate the effect of rhu-TNFR-Fc (etanercept) on the expression of TNF-α,TGF-β1 and VEGF in synovium of rats with adjuvant arthritis (AA).MethodsThe adult male Wistar rats were randomly divided into 5 groups: the rats in group Ⅱ～Ⅴ were injected with Freund complete adjuvant to induce the experimental animal models with AA,on the 12th day after induction,the rats in group Ⅲ were given MTX (2.7mg/kg.w) by gavage;the rats in groupⅣ and group Ⅴwere given etanercept by subcutaneous injection.After 28 days,the synovium of joint of rats was taken out to be HE stained,then synovium pathological score was calculated,and the expression levels of TNF-α,TGF-β1 and VEGF protein in synovium of knee joint were detected by histoimmunochemistry.ResultsThe expression levels of TNF-α,TGF-β1 and VEGF in group Ⅱ～Ⅴ were significantly higher than those in groupⅠ(P<0.05),The expression levels of TNF-α in group Ⅳ and group Ⅴ were obviously decreased,as compared with those in group Ⅱ (P<0.05),however,there were no significant differences between group Ⅲ and group Ⅱ (P>0.05).The expression levels of TGF-β1 and VEGF in rats' synovium tissues in group Ⅲ～Ⅴ were significantly lower than those in group Ⅱ(P<0.05).ConclusionEtanercept can obviously reduce the expression levels of TNF-α,TGF-β1 and VEGF in rats' synovium tissues,which has obvious therapeutic effect on joint inflammation of rats with AA.which may inhibit blood vessel neogenesis in local tissues.

adjuvant-induce-arthritis rat;rhu-TNFR-Fc;tumor necrosis factor-α;transforming growth factor-β1;vascular endothelial growth factor

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.07.002

062552 河北省任丘市，華北石油管理局總醫院腎內科

R 593.22

A

1002-7386(2014)07-0969-003

2013-11-07)