免疫膠體金法與培養(yǎng)方法檢測(cè)沙門氏菌檢測(cè)結(jié)果研究

劉景武 付素蘭 任天紅 張榮 張蕊 孫文澤

·論著·

免疫膠體金法與培養(yǎng)方法檢測(cè)沙門氏菌檢測(cè)結(jié)果研究

劉景武 付素蘭 任天紅 張榮 張蕊 孫文澤

目的評(píng)價(jià)自制沙門氏菌膠體金試紙對(duì)沙門氏菌檢測(cè)的真實(shí)性、可靠性和實(shí)用性．探討其用于沙門氏菌引起的食物中毒臨床標(biāo)本的快速檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值。方法用培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)，并用膠體金方法對(duì)同一份標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)膠體金方法的診斷試驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)作出計(jì)算。結(jié)果兩種方法的檢測(cè)結(jié)果之間有極好的一致性(Φ=0.903，Kappa=0.898)，膠體金法診斷沙門氏菌與金標(biāo)準(zhǔn)方法的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，膠體金法檢測(cè)沙門氏菌診斷試驗(yàn)的靈敏度為81.8%，特異性為100%，符合率為99.6%，陽性預(yù)測(cè)值為100%，陰性預(yù)測(cè)值為99.6%，假陰性率為18.2%，假陽性率為0。結(jié)論膠體金法在基層、和突發(fā)公共衛(wèi)生事件時(shí)，在對(duì)沙門氏菌檢測(cè)工作中具有一定的應(yīng)用價(jià)值．該方法的特異性高，一致性也較高，但其靈敏度仍有待提高。

沙門氏菌；免疫膠體金；培養(yǎng)；診斷試驗(yàn)

沙門氏菌是腸桿菌科中的一個(gè)重要菌屬，是人和動(dòng)物的常見病原菌。可引起人類多種疾病，如食物中毒、胃腸炎、菌血癥、腸熱癥等。目前，對(duì)于沙門氏菌有很多檢測(cè)方法，如免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、以及傳統(tǒng)的金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法。但是，在應(yīng)對(duì)突發(fā)公共衛(wèi)生事件時(shí)，快速準(zhǔn)確的判斷病原菌，成為診療的關(guān)鍵。雖然傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測(cè)方法本身證明是可靠的，但卻很費(fèi)力、耗時(shí)，需要4～7 d才能完成。而近幾年發(fā)展起來的膠體金免疫快速檢測(cè)法，是利用抗體膠體金標(biāo)記技術(shù)和膜層析技術(shù)研制而成，用于定性檢測(cè)標(biāo)本中的沙門氏菌。該法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果清晰，易于判斷，可廣泛應(yīng)用于臨床和基層醫(yī)療單位對(duì)可疑沙門氏菌標(biāo)本的快速檢測(cè)[1-4]。為了探討快速法在臨床標(biāo)本中的使用價(jià)值，我們對(duì)自制的沙門氏菌免疫膠體金試紙條與培養(yǎng)方法進(jìn)行比較，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，以確定其在沙門氏菌引起腹瀉的診斷價(jià)值，以滿足臨床需要。

1 材料與方法

1.1 試劑 SS、EMB購自購自北京市陸橋技術(shù)有限公司。沙門氏菌診斷血清購自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司。細(xì)菌生化鑒定板購自珠海迪爾生物工程有限公司。細(xì)菌生化鑒定儀購自珠海迪爾生物工程有限公司。沙門氏菌免疫層析條由本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 標(biāo)本 標(biāo)本為2011年5月至 2012年10月間，我院門診和病房腹瀉患者糞便標(biāo)本共520例。其中男性患者300例,女性220例；年齡7～75歲,平均年齡35歲。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法：取糞便標(biāo)本接種到SS、EMB培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)18～24 h，挑取可疑菌落，分離純化，同時(shí)做初步鑒定，同時(shí)用沙門氏菌多價(jià)血清(A-F)群進(jìn)行分群，最后用純化的菌做生化鑒定，用沙門氏菌診斷血清鑒定到種。

1.3.2 沙門氏菌免疫層析條檢測(cè)[5-7]：取1 g(1 ml)標(biāo)本加9 ml0.9%氯化鈉溶液混勻，500×g離心5 min。吸取上清液加入另一滅菌離心管中以14 000×g，離心10 min，沉淀用500 ml0.9%氯化鈉溶液懸浮 。在沸水中煮沸半小時(shí)。然后再用沙門氏菌免疫層析條檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)設(shè)陰陽性對(duì)照，以生理鹽水為陰性對(duì)照，結(jié)果判讀，檢測(cè)線和質(zhì)控線同時(shí)出現(xiàn)為陽性，只出現(xiàn)質(zhì)控線，為陰性，只出現(xiàn)檢測(cè)線，而無質(zhì)控線，需重做。用培養(yǎng)的方法和免疫膠體金法同時(shí)對(duì)520例標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，以培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，用四格表評(píng)價(jià)免疫膠體金法檢測(cè)的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 用培養(yǎng)的方法和免疫膠體金法同時(shí)對(duì)520例標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，其中培養(yǎng)的方法檢出11例陽性標(biāo)本,509例陰性標(biāo)本,而用免疫膠體金法檢測(cè)出9份陽性標(biāo)本, 511例陰性標(biāo)本。見表1。

獨(dú)立性檢驗(yàn)(pearsonx2檢驗(yàn))結(jié)果：N=520，pearsonx2=94．214，P=0.000，兩種沙門氏菌檢測(cè)方法的結(jié)果不獨(dú)立，說明兩種檢測(cè)方法所得結(jié)果之間具有關(guān)聯(lián)性，其列聯(lián)系數(shù)中為0.903，可認(rèn)為兩種檢測(cè)結(jié)果之間存在正關(guān)聯(lián)性；Kappa值為0.898，表明兩種方法的檢測(cè)結(jié)果之間的一致性為優(yōu)。

表1 免疫膠體金法檢測(cè)的結(jié)果與培養(yǎng)方法比較

配對(duì)設(shè)計(jì)的Mc Nemerx2檢驗(yàn)結(jié)果Mc Nemerx2P值為0.500，因此認(rèn)為膠體金法診斷沙門氏菌與金標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)結(jié)果之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 常用診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)的計(jì)算結(jié)果 自制沙門氏菌免疫膠體金試紙條的特異性為100%，靈敏度為81.8%。Youden指數(shù)越接近1，說明其診斷價(jià)值越大，本試劑的Youden指數(shù)為 81.8%，說明其診斷價(jià)值比較高。該試紙條與培養(yǎng)方法相比符合率達(dá)到99.6%。見表2。

表2 膠體金法診斷沙門氏菌試驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)

3 討論

通過實(shí)驗(yàn)可知自制沙門氏菌膠體金試紙條與培養(yǎng)方法相比較其診斷的靈敏度為81.8%，特異性為100%，假陽性率為0；假陰性率為18.2%，符合率達(dá)到99.6%。

目前，對(duì)于沙門氏菌有很多檢測(cè)方法，如免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、以及傳統(tǒng)的金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法。但是，在應(yīng)對(duì)突發(fā)公共衛(wèi)生事件時(shí)，快速準(zhǔn)確的判斷病原菌，成為診療的關(guān)鍵。雖然傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測(cè)方法本身證明是可靠的，但卻很費(fèi)力、耗時(shí)，需要4～7 d才能完成，已不能達(dá)到令人滿意的效果。分子生物學(xué)方法，雖然靈敏度高，可是操作繁瑣，技術(shù)性強(qiáng)，對(duì)人員要求嚴(yán)格，也不適合現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模應(yīng)用，而免疫膠體金技術(shù)，以其操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、不需專業(yè)培訓(xùn)就能滿足檢測(cè)的特點(diǎn)，非常適合突發(fā)公共衛(wèi)生事件時(shí)，快速檢測(cè)目的。但是該方法靈敏度低，受方法學(xué)限制，從方法學(xué)上提高靈敏度，不太可能，所以在臨床標(biāo)本檢測(cè)中，能不能通過建立一套前處理方法，以達(dá)到去除影響因子，提高靈敏度的目的呢？本研究使用自制沙門氏菌免疫膠體金試紙條，對(duì)糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)，實(shí)驗(yàn)將密度梯度離心法和煮沸處理相結(jié)合，采用密度梯度離心法，去除了糞便中大部分的顆粒物，再經(jīng)過煮沸處理，菌體破裂，暴露的抗體結(jié)合位點(diǎn)增多，并且顆粒變小后，在纖維素膜上的涌動(dòng)速度變快，從而大大提高了陽性檢出時(shí)間和檢出限，整個(gè)檢測(cè)時(shí)間在一小時(shí)內(nèi)完成，基本能滿足突發(fā)公共衛(wèi)生事件的要求，達(dá)到快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)目的[10，11]。

膠體金方法作為一種免疫學(xué)方法具有快捷迅速，大大縮短出結(jié)果時(shí)間；操作簡(jiǎn)便，不需任何儀器和設(shè)備；試劑穩(wěn)定，外界因素影響較小；成本低廉，所需試劑和樣本量少的特點(diǎn)越來越受到科學(xué)家的關(guān)注，并成功應(yīng)用于一些臨床檢測(cè)。但是在應(yīng)用中也暴漏出一個(gè)問題，那就是通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)膠體金法診斷沙門氏菌的靈敏度為81.8%，靈敏度則有待提高，容易造成漏診。所以在實(shí)際工作中只能做為輔助方法，不能代替培養(yǎng)的方法，在今后的工作中，我們將尋求改進(jìn)的方法提高其靈敏度。

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R 378.22

A

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2013-10-30)