北京地區(qū)攜帶OXA-1型超廣譜-內(nèi)酰胺酶志賀菌耐藥特點(diǎn)研究

苗元 盧立新 吳本和 王永全 靳博 崔京輝 張晶波 王全意

·藥物研究·

北京地區(qū)攜帶OXA-1型超廣譜-內(nèi)酰胺酶志賀菌耐藥特點(diǎn)研究

苗元 盧立新 吳本和 王永全 靳博 崔京輝 張晶波 王全意

目的了解本地區(qū)志賀菌中攜帶OXA-1型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(exteneded spectrum beta-lactamases,ESBLs)耐藥基因型及耐藥特征。方法收集2008至2011年分離出的志賀菌83株，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)OXA-1型耐藥基因，陽性產(chǎn)物序列在GenBank上比對(duì)確定基因亞型；對(duì)攜帶OXA-1型耐藥基因菌株按照Kirby-Bauer法進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，測(cè)定志賀菌對(duì)8種頭孢類抗生素耐藥情況。結(jié)果83株志賀菌中，21株攜帶OXA-1型ESBLs基因，陽性率為28.57%，其中21株福氏志賀菌檢出15株，61株宋內(nèi)志賀菌檢出6株。陽性產(chǎn)物均為OXA-1亞型。藥敏結(jié)果顯示，攜帶OXA-1型基因菌株對(duì)頭孢噻吩、頭孢唑林等頭孢類抗生素耐藥，對(duì)頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢吡肟和頭孢哌酮等頭孢類抗生素均敏感。結(jié)論本地區(qū)志賀菌中以攜帶OXA-1亞型ESBLs耐藥基因?yàn)橹?，在福氏志賀菌中檢出高于宋內(nèi)志賀菌，該基因與志賀菌對(duì)頭孢類抗生素的耐藥性呈一定相關(guān)性。

志賀菌；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶；OXA-1型；耐藥性

OXA型廣譜β-內(nèi)酰胺酶(exteneded spectrum beta-lactamases,ESBLs)是從20世紀(jì)80年代后期從絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶中分離，在分子分類上屬于D類，功能分類上屬于2d類ESBLs[1]，是對(duì)頭孢類抗生素耐藥的重要原因之一。OXA型ESBLs有OXA-1、OXA-2和OXA-10三個(gè)基因來源，但同源性僅為20%～30%，在分子水平上OXA型ESBLs分為5組，其中第Ⅲ組包括OXA-1、OXA-4、OXA-30和OXA-31等亞型[2]。在志賀菌中，攜帶OXA型酶菌株也常有報(bào)道，但檢出以O(shè)XA-1型ESBLs為主。為此，本研究收集了2008至2011年本地區(qū)從腹瀉患者糞便標(biāo)本中分離出的連續(xù)的不重復(fù)的志賀菌共83株，研究其OXA-1型ESBLs耐藥基因檢出情況，并對(duì)其進(jìn)行耐藥性分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2008至2011年本轄區(qū)內(nèi)北京兒童醫(yī)院、北京大學(xué)人民醫(yī)院、北京大學(xué)第一醫(yī)院，積水潭醫(yī)院等10家腸道門診開診期間上送菌株及本實(shí)驗(yàn)室從腹瀉病患者糞便標(biāo)本中分離培養(yǎng)的志賀菌共83株，其中福氏志賀菌21株，宋內(nèi)志賀菌61株，鮑氏志賀菌1株。

1.2 OXA-1型ESBLs耐藥基因檢測(cè) 采用煮沸法提取菌體及質(zhì)粒DNA。OXA-1型耐藥基因引物序列為：正向引物5’-ACACAATACATATCAACTTCGC-3’，反向引物5’-AGTGTGTTTAGAATGGTGATC-3’。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，30循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，美國(guó)Bio-Rad公司凝膠成像系統(tǒng)照相。引物序列由大連(寶)生物工程有限公司合成。

1.3 OXA-1型基因DNA測(cè)序及序列分析 PCR擴(kuò)增在美國(guó)Bio-Rad公司的iCycler PCR上進(jìn)行， PCR陽性擴(kuò)增產(chǎn)物委托北京金螺旋生物科技公司純化、測(cè)序。測(cè)序使用雙脫氧末端終止法，在ABI3730XL測(cè)序儀上進(jìn)行雙向測(cè)序，序列拼接后通過NCBI BLAST程序在GenBank上查詢比較，確定基因亞型。

1.4 藥物敏感性試驗(yàn) 根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果，將攜帶OXA-1型耐藥基因菌株，按照CLSI推薦的Kirby-Bauer法進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)測(cè)定對(duì)8種頭孢類抗生素耐藥情況?？咕幬镱^孢噻吩、頭孢唑林、頭孢西丁、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢吡肟、氨曲南及MH培養(yǎng)基干粉購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司。質(zhì)控菌株使用大腸埃希菌ATCC25922。

2 結(jié)果

2.1 OXA-1基因PCR檢測(cè)結(jié)果 83株志賀菌中共有21株檢出OXA-1型核酸陽性，陽性率為25.3%(21/83)。其中福氏志賀菌中檢出15株，宋內(nèi)志賀菌中檢出6株。對(duì)核酸陽性的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果拼接后，在GenBank上經(jīng)BLAST比對(duì)，全部為目的序列，無假陽性出現(xiàn)，基因亞型為OXA-1亞型。見表1。

表1 不同血清型志賀菌OXA型耐藥基因檢出結(jié)果

2.2 攜帶OXA-1型耐藥基因菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)核酸檢測(cè)結(jié)果，對(duì)檢出攜帶OXA-1型耐藥基因的21株志賀菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定根據(jù)Oxoid藥敏紙片說明書中規(guī)定腸桿菌科的抑菌環(huán)直徑解釋標(biāo)準(zhǔn)，判定耐藥(R)和敏感(S)。21株攜帶OXA-1型耐藥基因的志賀菌菌株對(duì)頭孢噻吩的耐藥性最高，耐藥率為61.90%，其次為頭孢唑林，耐藥率為28.57%。對(duì)頭孢噻肟、氨曲南等頭孢類抗生素有一定耐藥性，耐藥率都達(dá)到19.05%。對(duì)頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢哌酮和頭孢吡肟較敏感，耐藥率最高不超過10%。見表2。

表2 攜帶OXA-1型耐藥基因菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果 株

3 討論

有研究表明OXA型β-內(nèi)酰胺酶在不同類微生物體內(nèi)水解β-內(nèi)酰胺抗生素能力存在差異[3]，早期的文獻(xiàn)報(bào)道OXA型β-內(nèi)酰胺酶主要存在于銅綠假單胞菌[4]和鮑曼不動(dòng)桿菌[5]中，而在志賀氏菌中偶有發(fā)現(xiàn)[6]。但隨著近年志賀菌耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重及對(duì)耐藥機(jī)制的研究深入，志賀菌中檢出OXA型β-內(nèi)酰胺酶的報(bào)道逐漸增多。在國(guó)內(nèi)，葉穎子等[7]2008年從51株福氏志賀氏菌中檢出45株攜帶OXA-1群ESBLs基因，陽性率高達(dá)88.2%；紀(jì)文靜等[8]從2004-2008年期間搜集的59株志賀菌中檢出6株攜帶OXA-1亞型ESBLs基因；本實(shí)驗(yàn)對(duì)83株志賀氏菌進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，21株發(fā)現(xiàn)攜帶OXA-1亞型ESBLs基因，陽性率為25.3%。陽性率產(chǎn)生差異的原因與各地區(qū)用藥習(xí)慣不同有一定關(guān)系，但本研究發(fā)現(xiàn)OXA-1亞型ESBLs耐藥基因在福氏志賀菌中檢出率高于宋內(nèi)志賀菌，如此次從61宋內(nèi)志賀菌中只檢出6株(9.8%)攜帶OXA-1亞型耐藥基因，從21株福氏志賀菌檢出15株(71.4%)攜帶OXA-1亞型耐藥基因，福氏志賀氏菌OXA-1耐藥基因陽性率與葉穎子等的研究結(jié)果相近(88.2%)。而鮑春梅等[9]從43株多重耐藥宋內(nèi)志賀菌中未檢出OXA基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果也證實(shí)該基因在宋內(nèi)志賀菌中檢出率偏低，此發(fā)現(xiàn)為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道。

該酶之所以命名為OXA型酶，是因?yàn)槠涑桶逼S西林、頭孢噻吩外，對(duì)其他頭孢菌素的水解能力不一，但對(duì)苯唑西林、氯唑西林有很強(qiáng)的水解能力[10]。有國(guó)內(nèi)學(xué)者指出，是否攜帶OXA耐藥基因與志賀菌對(duì)β內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥率無關(guān)[8]。但本研究發(fā)現(xiàn)，攜帶OXA耐藥基因志賀菌對(duì)頭孢噻吩的耐藥率達(dá)到61.9%，對(duì)頭孢唑林的耐藥率達(dá)到28.6%，對(duì)頭孢噻肟、氨曲南等頭孢類抗生素有一定耐藥性。耐藥菌株中只有少部分?jǐn)y帶其它ESBLs類耐藥基因，如CTX-M、TEM、SHV等(另文發(fā)表)，說明其對(duì)頭孢類抗生素會(huì)產(chǎn)生一定耐藥性。

由于編碼OXA型酶的基因常位于質(zhì)粒和整合子中，具有很強(qiáng)的擴(kuò)散能力，所以控制其流行傳播刻不容緩。因此加強(qiáng)對(duì)該類型ESBLs耐藥基因的監(jiān)測(cè)，并結(jié)合藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以期達(dá)到指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物，延緩細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生，控制耐藥菌株的傳播以及研發(fā)穩(wěn)定、高效抗菌藥物方面具有十分重要的意義。

1 張卓然,夏夢(mèng)巖,倪語星主編.微生物耐藥的基礎(chǔ)與臨床.第1版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2007.127-130.

2 Bert F,Branger C,Lambert-Zechovsky N.Identification of PSE and OXA -lactamase genes in Pseudamanas aeruginosa using PCR-restriction fragment length polymorphism.J Antimicrob Chemother,2002,50:11-18.

3 周偉琳,俞云松,馬亦林.超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的分類.中國(guó)抗感染化療雜志,2002,12:245-248.

4 weldhagen G，Poirel L，Nordmann P．Ambler class A exterlded-spectrum beta-lactamases in Pseudomonas aeruginosa:novel developments and clinical impact.Antimicrob Agents Chemother,2003,47:2385-2392．

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6 Siu LK,Lo JY,Yuen KY,et al.β-lactamases in Shigella flexneri solates from Hong Kong and Shanghai and a Novel OXA-1-like β-lactamases,OXA-30.Antimicrob Agents Chemother,2000,44:2034-2038.

7 葉穎子,俞蕙,王曉紅，等.兒童福氏志賀菌OXA型β內(nèi)酰胺酶耐藥基因及其耐藥性檢測(cè).中國(guó)實(shí)用兒科雜志,2008,9:687-689.

8 紀(jì)文靜,徐樨巍,董方.兒科產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶志賀菌的基因型和耐藥性研究.中華微生物和免疫學(xué)雜志，2010,30:472-476.

9 鮑春梅,郭桐生,崔恩博，等.產(chǎn)ESBLs宋內(nèi)志賀菌耐藥基因分布研究.軍事醫(yī)學(xué),2011,2:122-127.

10 劉曉一,劉文恩.OXA型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的研究進(jìn)展.中國(guó)感染控制雜志,2010,6:462-467.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.07.055

項(xiàng)目來源:北京市西城區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：XCKJJH2013-27)

100120 北京市西城區(qū)疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科(苗元、盧立新、吳本和、王永全、靳博、崔京輝、張晶波)；北京市疾病預(yù)防控制中心(王全意)

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1002-7386(2014)07-1081-02

2013-10-12)