響應(yīng)面法優(yōu)化土茯苓總黃酮的提取工藝

★ 王敏 胡夢(mèng)梅 陳文龍 盧傳禮 朱偉

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 廣東 廣州 510000)

土茯苓為百合科植物光葉菝葜(SmilarglabraRoxb.)的干燥根莖，其性味甘、淡、平，歸肝、胃經(jīng)，具有解毒，除濕，通利關(guān)節(jié)之功，可用于梅毒及汞中毒所致的肢體拘攣，筋骨疼痛；濕熱淋濁，帶下，癰腫，瘰疬，疥癬等疾病[1]。化學(xué)成分研究表明，土茯苓根莖含有甾體皂甙、黃酮及黃酮甙類(lèi)、苯丙素類(lèi)、鞣質(zhì)等成分[2]。在各類(lèi)成分中，黃酮類(lèi)化合物被認(rèn)為是土茯苓中最重要的活性成分[3]。目前，在土茯苓總黃酮提取工藝研究方面，多采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[4,5]，其注重如何科學(xué)合理地安排實(shí)驗(yàn)，可同時(shí)考慮幾種因素，尋找最佳因素水平組合，但它不能在給出的整個(gè)區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間的一個(gè)明確的函數(shù)表達(dá)式即回歸方程。

響應(yīng)面分析法(response surface methodology， RSM)是一種優(yōu)化多變量系統(tǒng)的有效試驗(yàn)工具，可采用多元二次回歸方程來(lái)擬合多個(gè)因素與響應(yīng)值之間、因素與因素之間的函數(shù)關(guān)系，找出各因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值，有效地解決多變量問(wèn)題。由于響應(yīng)面分析法在優(yōu)化研究中具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、精確度高、降低成本、提高產(chǎn)出、優(yōu)化加工條件、解決生產(chǎn)過(guò)程中實(shí)際問(wèn)題等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于生物、化學(xué)、食品等領(lǐng)域[6,7]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，考察提取時(shí)間、乙醇濃度、提取溫度、料液比等提取條件之間交互作用對(duì)總黃酮提取率的影響，優(yōu)化土茯苓總黃酮的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料 土茯苓藥材購(gòu)自康美中藥飲片(批號(hào)：12120527)，經(jīng)廣東省中醫(yī)院藥學(xué)部陳燕芬主任中藥師鑒定為百合科光葉菝葜(SmilarglabraRoxb.)的干燥根莖，符合2010版《中國(guó)藥典》的規(guī)定。原料經(jīng)干燥，粉碎，過(guò)200目篩后得到均勻粉末，避光、干燥保存?zhèn)溆谩ＬJ丁(≥99%，成都曼斯特生物科技有限公司)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 總黃酮的提取 準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g土茯苓粉末置于大小適中的錐形瓶?jī)?nèi)，按不同的料液比(1∶10～1∶60 g/mL)加入一定濃度的乙醇溶液(15～90%，v/v)，搖均，放置于一定溫度(25～75℃)的恒溫水浴中，提取一段時(shí)間(10～60 min)，4000 r/min離心20 min，取出上清液，按上述步驟重復(fù)2次，合并上清液，定容，4℃避光保存，待測(cè)。

1.3 總黃酮的含量測(cè)定 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系，以蘆丁為基準(zhǔn)，進(jìn)行總黃酮的含量測(cè)定[6]。

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品0.004 0 g，70%乙醇溶解，并定容至10 mL，搖均，得質(zhì)量濃度為400 μg·mL對(duì)照品溶液，4℃避光保存，備用。將對(duì)照品溶液用70%乙醇溶液稀釋成一系列濃度(0，25，50，100，150，200，400 μg/mL)溶液。分別取0.5 mL上述溶液加入0.075 mL亞硝酸鈉溶液(5%)，搖均，放置6 min；然后分別加入0.075 mL硝酸鋁溶液(10%)，搖勻，放置6 min；再分別加入1 mL氫氧化鈉溶液(4%)，搖均，放置10 min后，490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，每組反應(yīng)液平行3次。以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，以蘆丁質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程Y=0.001 8X+0.037 3(r=0.999 7)，蘆丁在濃度25～400 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

1.3.2 樣品中總黃酮的提取率計(jì)算 取待測(cè)樣品溶液0.5 mL，用70%乙醇溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)?.3.1節(jié)方法測(cè)定樣品的吸光度，按下式計(jì)算總黃酮的提取率：

1.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過(guò)單因素預(yù)試驗(yàn)，選擇提取時(shí)間、乙醇濃度、提取溫度、料液比4個(gè)因素，采用Design Expert 7.0.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件中Box-Behnken的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定土茯苓中總黃酮的最佳提取條件。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平的編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 各因素單獨(dú)對(duì)總黃酮提取率的影響

圖2 各因素單獨(dú)對(duì)總黃酮提取率的影響

單因素實(shí)驗(yàn)分別考察了提取時(shí)間、乙醇濃度、提取溫度以及料液比4個(gè)因素，以總黃酮提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在確定其他參數(shù)不變的情況下改變其中一個(gè)參數(shù)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2A中可以看出總黃酮提取率隨著時(shí)間的增加而升高，藥材與溶劑接觸的時(shí)間延長(zhǎng)有利于土茯苓中總黃酮的溶出；在20 min時(shí)提取率達(dá)到最大，隨后緩慢下降至平緩。圖2B表明提取溫度越高，土茯苓總黃酮提取率越好，其可能的原因在于溫度升高促進(jìn)了溶劑分子的熱運(yùn)動(dòng)，同時(shí)降低了溶劑的黏性，更利于溶劑對(duì)于細(xì)胞壁的穿透性[5]，但溫度在65℃時(shí)提取率趨于平緩，故選取65℃為佳。由圖2C可見(jiàn)總黃酮提取率隨乙醇濃度升高而增加，當(dāng)乙醇濃度超過(guò)一定范圍時(shí)，提取率反而下降，這可能是由于黃酮易溶于中等或者中等偏上極性的溶劑中[9]，故選取55%為宜。圖2D結(jié)果表明，料液比增加，總黃酮提取率先上升后降低，當(dāng)料液比超過(guò)1∶20時(shí)，提取率增長(zhǎng)速度降低趨于平緩，雖在1∶40處提取率達(dá)到最大，但考慮到若采用較大的料液比時(shí)，一方面增加了乙醇的用量，另一方面也增加了后續(xù)工藝的難度，最終導(dǎo)致生產(chǎn)成本的增加，故選擇1∶20為宜。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化工藝實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與回歸模型的建立 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以提取時(shí)間(X1)、乙醇濃度(X2)、提取溫度(X3)和料液比(X4)四個(gè)因素為自變量，總黃酮提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了共29個(gè)實(shí)驗(yàn)組的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)平行3次，試驗(yàn)方案和結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.2 建立模型回歸方程與顯著性檢驗(yàn) 利用Design Expert 7.0.0軟件對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行多元線(xiàn)性回歸擬合，得到總黃酮提取率(Y)對(duì)提取時(shí)間(X1)、乙醇濃度(X2)、提取溫度(X3)、料液比(X4)的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=35.31+1.82X1+1.14X2+1.67X3+15.45X4+3.24X1X2+2.73X1X3+6.71X1X4+0.43X2X3+4.22X2X4+1.53X3X4-8.46X12-6.32X22-7.22X32-5.96X42

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

為考察上述回歸方程的有效性及各因素對(duì)提取率的影響程度，對(duì)上述回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可以看出模型極顯著(Prob>F值為0.009 1小于0.01)，而失擬項(xiàng)(Lack of Fit)不顯著(Prob>F值為0.132 2大于0.05)，說(shuō)明該方程對(duì)試驗(yàn)擬合較好。單個(gè)因素X4和二次項(xiàng)X12對(duì)響應(yīng)值的影響顯著。

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化工藝分析 為了進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用，利用Design Expert 軟件模擬了影響因素對(duì)總響應(yīng)因子交互影響的3D響應(yīng)曲面圖(圖3)，將其中兩個(gè)因素固定在零水平，考察另外兩個(gè)因素之間的交互作用。從曲面圖和對(duì)應(yīng)的等高線(xiàn)的形狀可以直觀反映出兩自變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形表示兩因素交互作用顯著[10,11]。

表3 響應(yīng)面分析法對(duì)總黃酮提取率的方差分析結(jié)果

圖3 各兩因素交互作用對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖

由圖3可以看出料液比和提取時(shí)間 (3c)、乙醇濃度(3e)、提取溫度 (3f) 兩兩之間的交互作用非常顯著，表現(xiàn)為曲面較陡，等高線(xiàn)沿料液比方向變化較快，而沿其他因素方向變化較慢。在實(shí)驗(yàn)水平下，料液比對(duì)提取率的影響比提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度顯著[12]。圖3a顯示了提取時(shí)間和乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響。可以看出，隨著提取時(shí)間和乙醇濃度的同時(shí)增大，提取率呈先增大后降低的拋物線(xiàn)趨勢(shì)，其原因有可能與黃酮類(lèi)物質(zhì)的極性大小和穩(wěn)定性有關(guān)[13]。但二者交互作用對(duì)提取率的影響不顯著。圖 3b 和3d與圖3a十分相似，等高線(xiàn)近似圓形，表明提取時(shí)間和提取溫度以及提取溫度和乙醇濃度交互作用對(duì)總黃酮提取率影響不顯著。

利用Design Expert 7.0.0軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行進(jìn)一步的典型性分析，得到最優(yōu)提取工藝條件為：提取時(shí)間35.2 min、乙醇濃度：58.05%、提取溫度：68.7℃、料液比1∶30，總黃酮提取率理論值為49.931%。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為檢驗(yàn)響應(yīng)面分析法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行土茯苓總黃酮的提取實(shí)驗(yàn)，考慮到實(shí)際情況，將修正后的最優(yōu)提取條件定為：提取時(shí)間35min、乙醇濃度58%、提取溫度69℃、料液比1∶30，提取次數(shù)3次，共進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，得到土茯苓總黃酮的平均提取率為49.003%，略低于理論值49.931%，其與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為1.89%，說(shuō)明響應(yīng)面法設(shè)計(jì)準(zhǔn)確，模型可靠，不失為土茯苓總黃酮提取工藝優(yōu)化的一種有效方法。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化出土茯苓總黃酮提取工藝的最優(yōu)條件為：提取時(shí)間35.2 min、乙醇濃度：58.05%、提取溫度：68.7℃、料液比1∶30，提取次數(shù)3次。根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況修正上述條件后，總黃酮提取率為49.003%，與理論值49.931%相差不大，相對(duì)誤差為1.89%，表明響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的參數(shù)條件準(zhǔn)確可靠，可為土茯苓藥材的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供了實(shí)驗(yàn)參考和依據(jù)。

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