基于四性角度探討中藥對DNA甲基化的干預作用*

★ 嵇琴 彭淑紅 張敏 孫振 章明 朱衛豐*

(1.江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室 江西 南昌 330004；2.江西中醫藥大學中醫基礎理論分化發展研究中心 江西 南昌 330004；3.江西中醫藥大學生命科學學院 江西 南昌 330004)

DNA甲基化是表觀遺傳學的重要組成部分，一般認為基因調控元件(如啟動子)的CpG中發生5mC的修飾，會在空間阻礙轉錄因子復合物與DNA結合，因此，DNA甲基化一般與基因沉默相關聯[1]。盡管有研究報道中藥對DNA甲基化修飾有影響[2]，但是鮮有文獻從中藥四性角度闡述中藥與DNA的甲基化的關系。中藥四性是中藥藥性理論的重要組成部分，它是指寒熱溫涼四種藥性，寒涼與溫熱是本質不同，互相對立的兩種藥性。凡能消除或減輕熱性病證的藥物，性屬寒涼；凡能消除或減輕寒性病證的藥物，性屬溫熱。此外，中藥藥性理論認為還存在平性藥物，是指寒熱之性不甚明顯，作用比較緩和的一類藥物。因此，本文就從中藥的寒涼、溫熱及平性的角度，綜述不同藥性對DNA甲基化修飾的影響，以探尋藥性與DNA甲基化修飾之間的關系。

1 DNA甲基化概述

DNA甲基化是最早被發現與基因抑制相關的表觀遺傳機制，它在維持正常細胞功能、胚胎發育、遺傳印記、以及人類腫瘤發生中起著重要作用,是目前新的研究熱點之一。它由DNA甲基轉移酶(DNA-methyl transferase, DNMT)催化，利用 S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基供體，將胞嘧啶的第五位碳原子甲基化，從而使胞嘧啶轉化為5甲基胞嘧啶(5mC)。哺乳動物中 DNMT 家族總共有5個成員，分別是DNMT3A、DNMT3B 、DNMT1、DNMT2和 DNMT3L，但只有 DNMT1、DNMT3A 和DNMT3B這3種酶有甲基轉移活性[3]。越來越多的研究表明中藥可以通過干預DNA的甲基化修飾過程，而發揮其治療的效果。

2 中藥對DNA甲基化的影響

2.1 寒涼性中藥對DNA甲基化的影響 一般來說，寒涼藥具清熱瀉火、清熱利尿、清化熱痰、涼血解毒、滋陰除蒸、瀉熱通便、清心開竅、涼肝熄風等作用。實驗發現四季三黃膠囊(主要由黃芩、黃柏、梔子、大黃等成分組成)可能通過提高動脈粥樣硬化( As)小鼠血清DNA 甲基化水平和DNMTs 水平，從而起到降低血清甘油三酯( TG) 水平，穩定As 斑塊的作用[4]。實驗還發現蜂膠乙醇提取物(EEP)也能夠提高或保持對小鼠心肌DNA甲基化水平，可能是因為EEP可以減輕自由基對于甲基化酶的破壞，從而保護DNA甲基化酶的結構，使DNA甲基化酶空間發生變構，使它更易于向甲基化位點轉移甲基，從而提高了DNA甲基化效率，使細胞延緩衰老[5]。然而苦參堿[6]可以降低整體細胞DNA甲基化水平從而誘導白血病K562細胞凋亡。

綠茶中的茶多酚以及生物黃酮能抑制DNMT催化的DNA甲基化[7]。天花粉蛋白(trichosanthin，TCS)也具有顯著的去甲基化作用，TCS是葫蘆科植物栝樓的塊根內的有效成分，TCS通過降低DNMTs的活性，對脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，SYK)基因具有顯著的去甲基化作用，從而抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖并誘導細胞凋亡[8]。

小白菊內酯 (Parthenolide) 是中藥野生甘菊的主要提取成分，小白菊內酯含有α-亞甲基-γ-內酯環和環氧化物結構[9]，小白菊內酯的γ-亞甲基內酯環通過烷基化反應中的Cys1226巰基的催化結構域硫醇鹽抑制 DNMT1；使 G1期細胞靜息或干擾轉錄因子Sp1與DNMT1啟動區結合，下調DNMT1表達[10]。

雷公藤甲素(triptolide，TP)又稱雷公藤內酯醇(triptolide，TL)，是從雷公藤根中分離出的二萜類化合物[11]。HL對細胞周期起負調控作用，主要是通過逆轉人惡性淋巴瘤CA46細胞異常甲基化的p16基因去甲基化[12]。HL可抑制人髓系白血病細胞系HL-60細胞增殖，誘導細胞凋亡，且不同濃度的TL抑制作用呈現時間-劑量依耐性，可能是通過下調甲基轉移酶基因DNMT1/3B mRNA的表達，降低LINE-1、DAPK-1基因甲基化程度，使DAPK-1基因表達上調實現的[13]。TP 也可明顯抑制人乳腺癌MCF-7細胞中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA的表達，抑制P53特別是 P73基因啟動子區甲基化，促進P53、P73的表達，并且能夠抑制MCF-7細胞的增殖[14]，TP可通過抑制甲基轉移酶使P53基因去甲基化,促進P53蛋白的表達,從而抑制SMMC-7721細胞的增殖[15]，TP還可以逆轉Jurkat細胞apc基因甲基化[16]。 18nM TL處理HT-1080細胞72小時后TL通過上調DNMT-1和一3A的表達，進而上調基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)基因的甲基化水平，最終抑制人纖維肉瘤HT-1080細胞的MMP-9基因的表達及活性[17]。

2.2 溫熱性中藥對DNA甲基化的影響 溫熱藥一般具溫里散寒、溫陽利水、溫經通絡、補火助陽、暖肝散結、引火歸原、回陽救逆等作用。姜黃素(curcumin)是從我國傳統中藥姜黃根莖中提取的一種植物多酚,它為一種強力的DNA甲基化抑制劑，通過與DNMT1的分子間的相互作用，抑制DNMT1的活性，從而使基因組整體的甲基化下降而發揮作用[18]。中濃度40umol/L與高濃度60umol/L姜黃素處理后的SGC-7901細胞、HeLa細胞、HepGZ細胞的p16基因和MGMT基因的啟動子區CpG島甲基化程度下降，表明姜黃素對腫瘤細胞P16基因和MGMT基因有一定的去甲基化作用[19]。姜黃素也可能上調鼻咽癌細胞回復引導半胱氨酸豐富蛋白含kazal基元( RECK) 基因表達，降低RECK甲基化水平，從而抑制 MMP-9 的表達與活性而發揮對 CNE-1 細胞生長抑制作用[20]。

參茸補血丸(由人參、鹿茸、杜仲、巴戟天等藥組成)能促進去勢大鼠生殖器官的發育，明顯降低肝、腎組織 DNA 甲基化酶活力和DNA甲基化水平，提高對應組織中 RNA 聚合酶活力，能使受損機體肝、腎組織低甲基化，基因高表達以代償因切除卵巢帶來整體效應低下[21]。

用補腎益精法軟皮湯方(熟地黃、阿膠、山茱萸、黃芪、山藥、紅花、茯苓等組成)含藥血清干預硬皮病成纖維細胞，可減少DNMT1 的表達[22]。丹參提取物丹參酮ⅡA也可明顯降低DNMT1基因的表達，且對肝癌HepG2細胞具有顯著的抑制作用[23]。

2.3 平性中藥對DNA甲基化的影響 樹舌多糖(gapsgf, GF)為樹舌的主要有效成分，應用限制性酶切片段長度多態性(RFLP)法觀察GF對小鼠HepA瘤基因組甲基化的影響,發現GF能明顯提高小鼠HepA瘤基因組甲基化的發生率，具體的分子機制尚不清楚，推測可能具有逆轉突變的5mC(T)的作用，可能是通過抑制癌基因的低甲基化或恢復基因的功能而實現的，也可能是通過使腺昔基蛋氨酸合成酶基因表達增高、和或使甲基化酶活性增高的作用而實現的。另外樹舌多糖具有明顯的抗腫瘤作用，且有誘導細胞凋亡的作用，能夠阻滯細胞周期，使S期細胞不能進入GZ-M期，阻滯于S期[24]。

2.4 藥性不明中藥對DNA甲基化的影響

2.4.1 抗衰老藥物衰老過程中DNA 甲基化水平呈下降趨勢，DNA甲基化酶活力隨大鼠年齡增加而明顯降低，DNA 甲基化酶活性隨衰老而下降[25]。小鼠腦、肝細胞DNA甲基化酶活力也隨著老鼠年齡的增高而下降，益腎健脾方劑能顯著提高生理性腎虛小鼠肝細胞甲基化酶的活力，用8.4%的益腎方和15.2%的健脾方喂養成年小鼠和老年(生理性腎虛組)小鼠8周后發現，給藥各組的小鼠肝、腦細胞DNA甲基化酶活力均明顯增高，其中對腦的作用益腎方(成年組增高30%，老年組增高18%)比健脾方(成年組增高21%;老年組增高13%)強；而對肝的作用健脾方(成年組增高61%，老年組增高63%)則明顯強于益腎方(成年組增高36%，老年組增高35%)[26]。除此之外，小鼠服用一定濃度的茶多酚后，有可能通過改變DNA甲基化酶的空間構象，使其更容易向正常甲基化位點轉移甲基，達到提高DNA 甲基化酶活性的目的，從而發揮抗衰老的作用[27,28]。神方補腎生血藥(主要由生地、山萸肉、龜版膠、阿膠、枸杞等十余味中藥組成)同樣能明顯提高老齡大鼠肝組織DNA甲基化酶活力和DNA甲基化水平，達到延緩衰老的作用[29,30],也可顯著提高老齡大鼠腦組織中DNA甲基化酶的活性，從而提高DNA甲基化酶的熱穩定性，還可提高大鼠腦DNA甲基化酶對NaCl的耐受性[31]。

2.4.2 治療腎病藥物中醫認為，腎病是由外邪侵襲，或勞欲過度，久病耗傷精氣等所致。腎病是一個很籠統的概念，簡單地說，只要腎臟有病，統統叫腎病。從糖尿病腎病大鼠的胰腺組織中提取基因組DNA，采用甲基化敏感性限制性核酸內切酶HpaII和MspI(為一組同裂酶)進行限制性酶切，并進行染色質DNaseI敏感性分析，發現糖維康(太子參、玄參、黃芪、僵蠶、丹參、水蛭等)治療糖尿病腎病后能向正常方向逆轉胰腺組織DNA 中CCGG位點甲基化狀態，通過提高基因轉錄水平和向正常方向恢復甲基化狀態而發揮治療糖尿病的作用[32]。慢性腎功能衰竭患者血清同型半胱氨酸水平升高發生率高達82.5%，其水平為正常人的2～3倍，尿毒清顆粒(大黃、黃芪、桑白皮、苦參、白術)可以使慢性腎功能衰竭大鼠基因組DNA從低甲基化狀態恢復到正常水平[33]，達到恢復慢性腎功能衰竭大鼠腎功能的作用。補腎中藥二至天癸顆粒(由女貞子、旱蓮草、枸杞子、菟絲子等組成)在一定程度上也可以糾正Snrpn和Peg1/Mest基因的異常去甲基化，改善腎虛小鼠受精卵卵裂率、囊胚形成率，發揮治療不孕癥的作用[34]。

2.4.3 治療狼瘡藥物 三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)是中藥砒霜的主要成分，它對MRL/lpr狼瘡鼠有一定的治療作用，作用機制有可能是通過升高狼瘡鼠脾臟單個核細胞DNMT1基因表達水平，從而達到改善狼瘡的DNA低甲基化狀態的目的[35]。砷劑也能引起 p53 和 p16 基因啟動子的高甲基化，并且甲基化程度與砷的劑量呈正相關[36]，ATO 處理的 MRL/lpr小鼠 CD4+T 細胞平均甲基化水平與空白對照組相比有明顯的上升[37]。我國更有許多實驗證明：ATO 能提高 MRL/lpr狼瘡小鼠的脾臟與淋巴結 DNA 整體甲基化水平[38]，從而下調 IFN-γ和 IL-4 的表達。有研究采用體外試驗給予 ATO 0.4 mg/(kg d) 隔日腹腔注射，證實 ATO 可改善 MRL/lpr自發性狼瘡小鼠脾臟單個核細胞的低甲基化狀態；體內試驗1 μmol/L ATO 作用 24 h 能在一定程度上有效逆轉活化狀態下 MRL/lpr狼瘡小鼠脾臟 CD4+T 細胞 IFN-γ基因啟動子低甲基化[39]，基于此認為 ATO 可能通過逆轉 SLE 的低甲基化狀態，從而治療SLE。

2.4.4 治療胃癌藥物 胃癌居我國惡性腫瘤死亡率首位[40], 嚴重威脅人類健康。解毒化瘀健脾方對異型增生胃黏膜細胞p16 、PTEN 基因具有一定的去甲基化作用，同時誘導p16、PTEN蛋白的高表達,對胃黏膜異型增生具有潛在的治療作用[41]。白藜蘆醇在濃度(0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)以劑量依賴性方式抑制人胃癌SGC-7901 細胞增殖，且隨著濃度的增加，RASSF1A甲基化的水平逐漸減弱，非甲基化水平逐漸增多。同時RASSF1A的mRNA 和蛋白表達水平明顯上調[42]，白藜蘆醇也能夠顯著改變糖尿病大鼠主動脈的細胞因子基因的甲基化狀態[43]。以N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(MNNG )為主的多因素聯合攻擊法誘發的胃癌前病變大鼠檢測出抑癌基因 E-cadherin、p16 發生高甲基化及基因c-myc發生低甲基化，胃寧顆粒(主要成分為黃芪、白花蛇舌草、莪術、枸杞等)對E-cadherin 基因甲基化無相關作用; 對 p16、c-myc基因甲基化發生相關調控作用[44]。消痰散結方(有半夏、膽南星、茯苓、枳實、陳皮、炙甘草等組成)能降低胃癌P16基因啟動子區域甲基化水平，增加P16基因mRNA的表達,從而有效抑制胃癌細胞系以及裸鼠原位移植瘤的生長[45]。

2.4.5 治療乳腺癌藥物乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在婦女僅次于子宮癌，已成為威脅婦女健康的主要病因，二氫楊梅素顯著誘導乳腺癌細胞 PTEN 基因去甲基化，促進其表達，其機制可能主要涉及對 DNMT1 表達和活性的抑制[46]。紫杉醇[47]可以降低整體細胞DNA甲基化水平從而誘導乳腺癌細胞凋亡。

2.4.6 治療骨髓增生異常綜合征藥物青黃散(由青黛、雄黃組成)通過抑制DNMTl mRNA的表達使S-腺苷甲硫氨酸(SAM)向S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)的進一步代謝減弱，結果使SAM向DNA提供的甲基基團減少，降低了DNA的甲基化，從而改變骨髓增生異常綜合征(MDS)患者高甲基化狀態起到治療骨髓增生異常綜合征(MDS)作用[48]。

2.4.7 其它 口服蜂王漿對雄性大、小鼠腦、肝、腎及血液DNA甲基化水平沒有影響[49]。血府逐瘀膠囊(主要由桃仁、紅花、赤芍、川芎等成分組成)可提高動脈粥樣硬化( As)小鼠血清DNA 甲基化水平和DNMTs 水平，從而起到降低血清甘油三酯( TG) 水平，穩定As 斑塊的作用[4]。槲皮素可以通過降低RASSF1A、p16INK4a和Erb基因啟動子區的甲基化水平，從而阻滯細胞周期停留在G0/G1期[50]。愈肝顆粒(由茵陳、黨參、梔子等13味中藥組成)通過降低DNMT1、DNMT3A和DNMT3B表達水平，從而調整DNA的甲基化狀態同樣可以起到防治肝癌發生的作用[51]。

表1 四性中藥與DNA甲基化相關研究結果一覽表

3 小結與展望

中藥四性是中藥藥性的核心，客觀準確的判別中藥的四性是中藥藥性研究的難點和熱點。隨著近年來人們對DNA甲基化的研究深入和對中藥干預甲基化實驗的逐步展開，該課題組對DNA甲基化修飾與中藥藥性之間是否有某種聯系產生了很大的興趣。因此，文章通過綜述中藥對DNA甲基化的研究報道，將其歸納總結為表1。通過文獻整理，可以看出：(1)目前報道的寒涼藥對DNA全基因組甲基化的作用有升高也有降低；(2)目前報道的溫熱藥均顯示出能降低DNA甲基化酶活力或DNA甲基化水平的作用；(3)平性藥干預DNA甲基化水平的報道并不多；(4)對于DNA甲基化干預作用中藥，大多藥性不明，不便歸類。

鑒于目前對于已確定藥性的中藥作用于DNA甲基化的研究并不太多，以及寒熱或溫涼作用的靶點不一，即使同一藥性的中藥作用靶點也不一樣，因此找出DNA甲基化與中藥藥性之間的確切關系仍面臨種種困難。另外，目前中藥干預DNA甲基化的研究均是個別中藥，尚無針對寒熱或溫涼藥物與DNA甲基化修飾的系統研究，所以也增加了對藥性規律統計的難度。相信隨著中藥干預DNA甲基化研究的不斷深入和擴展，中藥干預DNA甲基化的具體靶點和機制的逐漸明確，以及未來對中藥四性與DNA甲基化系統性研究的力度加大將極大促進中藥藥性的本質闡釋和客觀化判別進程。

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