表沒食兒茶素沒食子酸酯對帕金森病大鼠的神經保護作用及其機制探討

吳艷芬，劉漢杰，張延平，王 偉*（.河北省邯鄲市第一醫院內分泌科，河北 邯鄲 05600；.河北醫科大學第二醫院神經外科，河北 石家莊 050000；.河北省邯鄲市第一醫院神經內科，河北 邯鄲 05600）

·論著·

表沒食兒茶素沒食子酸酯對帕金森病大鼠的神經保護作用及其機制探討

吳艷芬1，劉漢杰2，張延平3，王 偉3*
（1.河北省邯鄲市第一醫院內分泌科，河北 邯鄲 056001；2.河北醫科大學第二醫院神經外科，河北 石家莊 050000；3.河北省邯鄲市第一醫院神經內科，河北 邯鄲 056001）

目的觀察表沒食兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate,EGCG）對魚藤酮致帕金森（Parkinson disease,PD）大鼠模型黑質多巴胺能神經元的保護作用。方法健康成年雄性Wistar大鼠60只，隨機分為對照組、實驗組和藥物干預組（每組20只）。實驗組和藥物干預組背部皮下注射魚藤酮制備PD大鼠模型，藥物干預組同時給予大鼠腹腔注射EGCG。采用分光光度法檢測大鼠腦內丙二醛（malondialdehyde,MDA）和還原型谷胱甘肽（glutathione,GSH），免疫組織化學和Western blot檢測大鼠中腦黑質及紋狀體中酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase,TH）的表達變化。結果實驗組大鼠紋狀體中MDA明顯增高（P<0.05），GSH含量明顯降低（P<0.05），中腦TH免疫反應陽性神經元數明顯少于對照組（P<0.05）,TH蛋白在黑質和紋狀體與對照組比較明顯降低（P<0.05）；EGCG干預后與實驗組相比MDA明顯降低及GSH明顯增高（P<0.05）,TH免疫反應陽性神經元數明顯增加（P<0.05）,TH蛋白明顯增加（P<0.05）。結論化應激在PD發病中起著非常重要的作用，抗氧化治療能有效減輕大鼠腦內多巴胺能神經元損傷情況，同時改善PD樣癥狀，為PD的治療提供了新的靶點。

帕金森病；表沒食兒茶素沒食子酸酯；多巴胺

帕金森病（Parkinsondisease，PD）是發生在中老年人群中較為常見的中樞神經系統退行性疾病，其特征性病理變化是黑質多巴胺能神經元變性壞死及Lewy小體形成導致黑質紋狀體通路破壞及尾狀核、殼核中多巴胺含量減少，臨床主要表現為靜止性震顫、運動遲緩、肌張力增高等[1]。最近的研究[2]結果顯示氧化應激損害在PD黑質多巴胺神經元死亡過程中起著非常重要的作用。抗氧化治療PD已成為新療法中的重要研究方向。表沒食兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate,EGCG）是從天然植物茶葉中分離提純出來的多酚類化合物復合體茶多酚的重要成分，EGCG具有良好抗氧化效應，在許多神經變性疾病中顯示出神經保護作用[3]。本研究觀察EGCG對魚藤酮制備PD動物模型腦內多巴胺能神經元的保護作用，為PD治療提供一個新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組和動物模型的制備：Witstar大鼠60只，雄性，體質量250～300g，由河北省實驗動物中心提供。將動物隨機分為對照組、實驗組和藥物干預組；對照組20只背部皮下注射葵花油1mL/kg，實驗組和藥物干預組各20只，按照2.0mg·kg-1·day-1背部皮下注射魚藤酮（魚藤酮溶解在葵花籽油中，充分振蕩混勻后4℃避光保存），其中藥物干預組在魚藤酮注射前半小時給予EGCG50mg·kg-1·day-1腹腔注射，共30d。飼養于晝夜交替的環境中，其間所有大鼠自由進食水。

1.2 腦組織丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）的含量測定：大鼠直接斷頭取腦，迅速分離紋狀體，液氮速凍，-80℃保存，用于測量MDA和GSH，具體實驗方法按所購試劑盒說明書進行。

1.3 免疫組織化學染色：大鼠深度麻醉下以4%多聚甲醛（4℃）經心灌注固定,取腦固定4h,30%蔗糖液4℃過夜。所需部位冠狀位冷凍連續切片（厚40μm）,間斷集片,磷酸緩沖液洗片后行免疫細胞化學反應。相關切片分別以小鼠抗酪氨酸羥化酶（tyrosinehydroxylase,TH）單克隆抗體（1∶3 000,Sigma）4℃孵育切片48h;生物素化羊抗小鼠IgG（1∶500）室溫孵育切片2h,1∶500HRP鏈霉卵白素室溫孵育1h。每步中間以Tris緩沖液洗片。二氨基聯苯胺（diaminobenzine,DAB）呈色、貼片、封片、觀察。以正常羊血清代替一抗,作為陰性對照。

1.4 細胞計數：在光鏡40倍物鏡下,按James等方法,分別計數相關核團1cm2面積TH（黑質致密部）免疫反應陽性神經元數目。

1.5Westernblot：大鼠快速斷頭取腦,置于冰板上選取黑質及尾殼核所在腦塊,入液氮速凍后入低溫冰箱備用。取所需腦組織入4℃裂解液勻漿5min,冰浴靜置1h,4℃離心,取上清,Bradford法測定蛋白濃度。相關樣品取50μg總蛋白經10%SDS-PAGE凝膠電泳分離,電轉移至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉室溫封閉2h后,依照實驗目的分別加入5%脫脂奶粉稀釋的小鼠TH單克隆抗體（1∶10 000）,4℃過夜。聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidenefluoride,PVDF）膜以Tris緩沖液洗3次。羊抗小鼠IgG熒光抗體（1∶10 000，Rocland公司）室溫避光1h，漂洗5次，遠紅外熒光掃描成像系統（Odyssey公司）掃描并測定目標蛋白單位光密度值，與β-actin（1∶5 000，SantaCruz）比值后，做統計學分析。

2 結 果

2.1 一般狀況：與對照相比較,實驗組大鼠有主動活動減少、動作遲緩、步態不穩、不能直線行走、行走時多向一側旋轉的行為表現;毛色變黃變臟,體態呈弓背狀。藥物干預組大鼠的上述癥狀有明顯改善，向一側旋轉的癥狀明顯減輕。

2.2 免疫組織化學結果：實驗組大鼠黑質TH陽性神經元數目較對照組明顯減少（P<0.05）;藥物干預組黑質TH陽性神經元數目較實驗組明顯增高（P<0.05），但較對照組仍有明顯減少（P<0.05）。見表1。

2.3Westernblot結果：實驗組大鼠TH蛋白在黑質及尾殼核比對照組明顯減少（P<0.05）；藥物干預組TH蛋白在黑質及尾殼核較實驗組明顯增高（P<0.05）,但是較對照組仍有明顯減少（P<0.05）。見表1。

2.4 大鼠紋狀體中氧化應激參數的改變:實驗組大鼠紋狀體中GSH的含量比對照組明顯減少（P<0.05）；藥物干預組GSH明顯增加（P<0.05）,但較對照組仍明顯減少（P<0.05）。實驗組脂質代謝產物MDA含量較對照組明顯增加（P<0.05）；藥物干預組MDA明顯減少（P<0.05）,但較對照組仍明顯增高（P<0.05）。見表1。

GroupsTHpositiveneuronsinSN（number）TH/β?actininSNTH/β?actininstriatumMDAinstriatum（nmol/mg）GSHinstriatum（mg/g）Control34．35±4．040．75±0．070．64±0．025．21±1．5543．73±4．58PD20．27±3．05?0．45±0．08?0．39±0．05?19．13±2．04?28．40±2．61?EGCG+PD25．97±3．02?#0．59±0．01?#0．51±0．03?#10．24±3．21?#35．42±3．21?#

*P<0.05vscontrol group #P<0.05vsPD group byqtest
PD：Parkinson disease；TH：tyrosine hydroxylase；SN：substantia nigra；MDH：malondialdehyde；GSH：glutathione

3 討 論

PD是最常見的神經變性病之一，其病理改變主要是黑質內多巴胺能神經元漸進性受損。氧化應激參與脂質過氧化，導致體內氧自由基過度蓄積，可能是引起黑質多巴胺能神經元損傷的重要原因之一，從而促進PD的病理過程,PD患者腦內氧化應激損傷包括腦內脂質過氧化增加、還原性谷胱甘肽耗竭及DNA損害等[4-6]，這些均提示氧化應激在PD多巴胺能神經元損傷過程中發揮著一定的作用，因此抗氧化治療是延緩疾病進展的一條途徑。本研究發現魚藤酮處理后大鼠腦內發生了明顯的氧化應激，脂質代謝產物MDA含量明顯增高，同時自由基清除劑GSH含量明顯降低,表明紋狀體中氧化平衡被破壞，發生了氧化損傷。魚藤酮是一種源于某些植物根莖一直被視為安全的廣泛應用于果蔬除害等方面的天然殺蟲劑。魚藤酮對黑質多巴胺能神經元具有明顯的神經毒性作用[7]，接觸魚藤酮的大鼠可出現PD樣癥狀及帕金森病理性改變[8]。魚藤酮為制備PD動物模型的有效藥物，本研究中也發現魚藤酮能導致大鼠腦內氧化應激及多巴胺能神經元損傷，同時也證明了氧化應激在PD的發病中起著非常重要的作用。這也為臨床上對PD患者抗氧化治療提供了理論依據。

EGCG是從綠茶中提取出來的多酚類化合物，其酚羥基是天然的供氫體，能夠提高內源性抗氧化酶生成，在體內外均具有很強的清除自由基和抗氧化的功能[9]。最近研究[10]表明，EGCG具有多種藥理學作用，如較強清除自由基、抗脂質過氧化、抗凋亡、抗病毒、預防癌癥和心臟病等。氧化應激與PD病理機制密切相關，飲食來源可能成為預防和治療PD有效的抗氧化劑替代品。本研究結果顯示，魚藤酮背部皮下注射可以導致大鼠腦內氧化應激及多巴胺能神經元損傷而出現PD樣癥狀，給予大鼠EGCG，通過降低黑質多巴胺能神經元脂質過氧化狀態，調節抗氧化蛋白酶的活性，增加總蛋白的合成能力，減少神經細胞的損傷，可改善大鼠PD樣癥狀，抗氧化治療可能是PD治療的新靶點。

[1] 崔利德,王立軒,李陳莉.褪黑素的抗氧化作用對抗神經損傷的研究進展[J].河北醫科大學學報，2006，27（3）：218-221.

[2] BISAGLIA M,GREGGIO E,BELTRAMINI M,et al.Dysfunction of dopamine homeostasis:clues in the hunt for novel Parkinson′s disease therapies[J].FASEB J，2013，27（6）:2101-2110.

[3] SMID SD,MAAG JL,MUSGRAVE IF.Dietary polyphenol-derived protection against neurotoxic β-amyloid protein:from molecular to clinical[J].Food Funct，2012，3（12）:1242-1250.

[4] HIRSCH EC.Future drug targets for Parkinson′s disease[J].Bull Acad Natl Med，2012，196（7）:1369-1377.

[5] TOLLESON CM,FANG JY.Advances in the mechanisms of Parkinson′s disease[J].Discov Med，2013，15（80）:61-66.

[6] SURMEIER DJ,SULZER D.The pathology roadmap in Parkinson disease[J].Prion，2013，7（1）:85-91.

[7] CANNON JR,TAPIAS V,NA HM,et al.A highly reproducible rotenone model of Parkinson′s disease[J].Neurobiol Dis，2009，34（2）:279-290.

[8] XIONG N,HUANG J,ZHANG Z,et al.Stereotaxical infusion of rotenone:a reliable rodent model for Parkinson′s disease[J].PLoS One，2009，4（11）:e7878.

[9] MURAKAMI A,OHNISHI K.Target molecules of food phytochemicals:food science bound for the next dimension[J].Food Funct，2012，3（5）:462-476.

[10] CHEN D,WAN SB,YANG H,et al.EGCG,green tea polyphenols and their synthetic analogs and prodrugs for human cancer prevention and treatment[J].Adv Clin Chem，2011，53:155-177.

（本文編輯：趙麗潔）

MECHANISMOFEPIGALLOCATECHIN-3-GALLATENEUROPROTECTIONINPARKINSONDISEASERATSINDUCEDBYROTENONE

WUYanfen1,LIUHanjie2,ZHANGYanping3,WANGWei3*
（1.DepartmentofEndocrinology,theFirstHospitalofHandanCity,HebeiProvince,Handan056001,China；2.DepartmentofNeurosurgery,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China;3.DepartmentofNeurology,theFirstHospitalofHandanCity,Handan056001,China）

ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectofepigallocatechin-3-gallate（EGCG）onthesubstantianigradopaminergicneuroninParkinsondisease（PD）ratsinducedbyrotenone.MethodsThehealthyadultmale60Wistarratswererandomlydistributedtothefollowinggroupscontrolgroup,PDgroupanddrugtherapygroup（n=20eachgroup）,PDanddrugtherapygroupswereinjectedsubcutaneouslyrotenoneinthebacktopreparethePDratsmodel,theratsofdrugtherapygroupwereinjectedintraperitoneallyEGCGatthesametime.Spectrophotometrywasusedtodetectoxidativestressparametersinrats（malondialdehydeandglutathione）,immunocytochemistryandwesternblotwereusedtodetecttheexpressionoftyrosinehydroxylase（TH）inthesubstantianigraandstriatumofrats.ResultsMalondialdehyde（MDA）wassignificantlyhigher（P<0.05）,andglutathione（GSH）wassignificantlydecreased（P<0.05）intheratsstriatumofrotenonegroupthanthoseofcontrolgroup.ThenumberofTHpositiveneuronsinmidbrainwassignificantlylessthanthatofcontrolgroup（P<0.05），buttheexpressionofTHwassignificantlydecreasedinthesubstantianigraandstriatumcomparedwithcontrolgroup（P<0.05）;MDAobviouslydecreasedandGSHincreasedsignificantlyaftertheinterventionofEGCGcomparedwiththatofrotenonegroup（P<0.05）,thenumberofTHpositiveneuronssignificantlyincreased（P<0.05）andTHproteinincreasedsignificantly（P<0.05）.ConclusionOxidativestressplaysaveryimportantroleinthepathogenesisofPD,anti-oxidationtreatmentcaneffectivelyreducetheinjuryofdopaminergicneuronsinthebrainofrat,whichprovidesanewtargetforthetreatmentofPD.

Parkinsondisease;epigallocatechin-3-gallate;dopamine

2013-02-21；

2013-03-26

河北省科學技術研究與發展指導計劃項目（132777134）

吳艷芬（1978-），女，河北邯鄲人，河北省邯鄲市第一醫院主治醫師，醫學碩士，從事內分泌疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail:sunnywangwei@163.com

R743

A

1007-3205（2014）05-0501-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.05.003