不同淋巴結轉移潛能口腔鱗癌細胞株snail基因及蛋白表達的研究

申葉春 李立恒 蔡艷霞 張凡

·論著·

不同淋巴結轉移潛能口腔鱗癌細胞株snail基因及蛋白表達的研究

申葉春 李立恒 蔡艷霞 張凡

目的探討口腔鱗癌細胞株snail基因及蛋白表達與淋巴結轉移關系。方法復蘇傳代口腔鱗癌高、低淋巴結轉移潛能細胞株，流式細胞術和RT-PCR檢測培養12、24、36、48、60、72 h時間節點snail基因及蛋白表達差異。結果流式細胞術檢測結果顯示：高淋巴結轉移細胞株snail蛋白的陽性表達率為(48±4)%，低淋巴結轉移株為(20±4)%，高轉移細胞株明顯低于低轉移細胞株，差別有統計學意義(P<0.05)。RT-PCR擴增結果顯示：snail mRNA在高淋巴結轉移口腔鱗癌細胞株中6個不同培養時間節點均存在高表達，而在低轉移組細胞株中呈低表達，差異有統計學意義(P<0.05)。結論snailmRNA及蛋白的表達在不同淋巴結轉移潛能的口腔鱗癌細胞株間存在明顯的差別，高表達該基因及其蛋白可能是口腔鱗癌淋巴結轉移的分子基礎。

口腔鱗癌； snail； RT-PCR；流式細胞術；淋巴結轉移潛能

口腔鱗癌的細胞形態學改變是其脫離原發灶，間質浸潤和遠處淋巴結轉移的基礎，而上皮間質轉換在其中發揮重要作用。上皮細胞來源的惡性腫瘤在其外形改變的同時細胞表面的表型也發生變化，上皮表型表達減弱，間質細胞表型增加，snail是上皮間質轉換的調節因子，下調E-cadherin表達的同時上調間質表型表達，同時因此本實驗利用細胞培養、流式細胞術和RT-PCR檢測口腔鱗癌不同淋巴結轉移潛能細胞株snail基因及蛋白的差異，從形態和分子機制對口腔鱗癌淋巴結轉移機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及設備 口腔鱗癌淋巴結高轉移細胞株(SCC-LH)、低轉移細胞株(SCC-LL)由北京大學醫學部口腔醫學院惠贈。RPMI-1640細胞培養基(lnvin’ogen公司)；新生小牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；胰蛋白酶A、青霉素、鏈霉素(華北制藥股份有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司)；snail-FITC檢測試劑盒(南京凱基生物)；CO2培養箱(科俊儀器有限公司)；低溫高速離心機D-78532 (德國 Hettich Zentrifugen 公司) FAC Sort 流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 細胞復蘇 實驗室常規消毒，紫外照射40 min，培養液(DMEM)、0.25%胰蛋白酶(Trypsin)恒溫水浴箱37℃預熱20 min，從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入40℃水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化，將細胞懸液移入15 ml離心管，緩慢加入4 ml培養液，離心(1 000 r/min，5 min)，用培養液懸液混懸沉淀細胞，調整細胞濃度，放培養箱中培養。

1.3 細胞傳代培養 紫外線照射超凈工作臺30 min，用75%乙醇擦拭雙手，預熱培養液，兩種細胞株均在含10%小牛血清、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 U/ml)雙抗的RPMI-1640培養液中培養，溫度37℃、相對濕度90%、體積分數為5%CO2的培養箱中進行培養，定期觀察細胞生長情況，每隔2～3 d用0.25%胰酶消化，進行傳代培養。在倒置顯微鏡下觀察消化細胞，當原貼壁細胞逐漸趨于圓形，細胞質回縮，細胞間不在連接成片時為合適消化程度，加入新的培養液停止消化。用彎頭吸管吸取培養液，反復吹打成細胞懸液，吸出適量細胞懸液分裝到2～3個培養瓶中，加入適量的培養液后旋緊瓶蓋，以乙醇棉球擦拭外壁適當旋松瓶蓋，放入二氧化碳培養箱中繼續培養，換液及傳代時間有細胞生長情況而定。

1.4 流式細胞儀檢測snail蛋白在不同細胞株中的表達 各實驗管中分別加入106 PBMC，1 500 r/min離心3 min，棄上清；分別加入熒光素標記的抗snail的單克隆抗體20 ml，混勻； 4℃冰箱孵育60 min， 加入細胞洗液 ， 1 500 r/min離心3 min，反復洗滌3次；用細胞洗液恢復體積至0.5 ml，加入固定液20 ml，混勻；上機檢測。

1.5 培養細胞總RNA制備 PBS溶液對細胞沖洗2次，棄去PBS液，加入Trizol液1 000 μl進行消化，用1 ml加樣器將已消化的細胞吹勻，直至液體澄清，且無細胞團塊，放置于室溫內靜置10 min， 加入0.2倍體積氯仿，經過15 s的振蕩后再靜置于室溫內15 min，12 000 r/min、4℃離心15 min， 將上層無色的水樣液體，轉移至新的試管中，將0.5倍體積的異丙醇加入試管中后顛倒使其混勻，放置于-20℃下靜置15 min,12 000 r/min、4℃離心10 min,即可有微量的RNA沉淀在管底， 小心吸取上清液丟棄，用1 ml 75%乙醇將RNA沉淀洗滌，振蕩混勻后，7 500 r/min、4℃離心5 min。小心吸取上清液丟棄，將試管輕倒置在濾紙上，盡量除盡殘余的上清液，在室溫下適度干燥5～10 min，將其完全溶解在20 μl 0.1%DEPC水中，取1～2 μl樣品測純度與濃度，剩余的放置在-70℃保存。

1.6 逆轉錄合成 cDNA snail基因預產物984 bp，上游引物序列：5’-GCCATGATGGTGCATGACCGGTTAG3’，下游引物5’-AGTCCGTAAATTGGGGCCATGC3’,以小鼠β-actin為內參照，基因庫序列號(NM-007393)，引物名稱R607，序列AGGATGGCGTGAGGGAGAGA,擴增長度517 kb,上游引物：5’-GCATGCTCTATAGGAACGCG3’,下游引物：5’-CGATGGCAATCCTTACGTAAC3’。按照RT-PCR試劑盒說明逐步建立逆轉錄反應體系，本研究建立25 μl體系：將試劑盒內的試劑溶液全部置于冰槽中，使其全部融化后，預熱PCR儀至50℃。以上試劑融化后渦旋振蕩2 s后再經微型離心機瞬時離心5 s，放置于冰槽內。見表1。

表1 RCR反應體系

PCR產物-20℃冰箱保存。PCR產物8 μl加5×Loading Buffer 2 μl 2%瓊脂糖凝膠電泳120 V，100 mA 30 min溴化乙錠染色，凝膠成象儀成象并保存結果，采用基因公司凝膠成像分析系統成像并進行數據分析。

2 結果

2.1 不同培養時間不同細胞株的形態學觀察 高淋巴結轉移細胞株呈梭形排列，粘附性較差，隨傳代時間的延長，細胞異型性更加明顯、且梭形變較突出；低轉移細胞株呈圓形或卵圓形，細胞粘附性差，體積較小，細胞異型性不明顯。見圖1～4。

圖1 高轉移細胞株傳代培養12 h(EB×100)圖2 高轉移細胞株傳代培養36 h(EB×100)

圖3 低轉移細胞株傳代培養12 h(EB×40) 圖4 低轉移細胞株傳代培養36 h(EB×40)

2.2 流式細胞術檢測兩種細胞株snail蛋白表達結果 高淋巴結轉移細胞株snail蛋白的陽性表達率在不同培養時間節點的表達率為54%～47%，平均(48±4)%，低淋巴結轉移株原型表達率為16%～23%，平均(20±4)%，高轉移細胞株snail蛋白陽性表達明顯高于低轉移細胞株，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5、6。

圖5 流式細胞儀檢測低淋巴結轉移細胞株Snail蛋白散點圖 圖6 流式細胞儀檢測高淋巴結轉移細胞株Snail蛋白散點圖

2.3 兩種細胞株不同培養時間的snail基因檢測結果 兩種細胞株均存在snail基因的表達，且隨培養時間的延遲表達均較為恒定；但是高淋巴結轉移細胞株的表達水平明顯高于高轉移細胞株表達水平。見圖7、8。

圖7 低淋巴結轉移細胞株不同培養時間snail基因檢測結果

圖8 低淋巴結轉移細胞株不同培養時間snail基因檢測結果

3 討論

口腔鱗癌惡性程度大小主要取決于局部侵襲和遠處轉移。同樣的口腔鱗癌患者在局部復發和遠處轉移等方面存在明顯差異，導致不同的預后，與腫瘤細胞自身不同的異質性和基因組不穩定性密切相關[1，2]。有研究顯示口腔鱗癌浸潤前沿的腫瘤細胞出現去分化，低表達上皮細胞表型，細胞出現梭形變，更具侵襲性，而中央區域的腫瘤細胞容易出現壞死，分化程度高[3，4]，因此該腫瘤的淋巴結轉移始動因素與浸潤前沿的細胞表面的粘附分子改變以及細胞形態變異密切相關。

上皮間質轉換是胚胎時期器官發育的關鍵環節，在多種生理過程中出現，與腫瘤局部浸潤和侵襲力密切相關，上皮細胞關鍵分子E-cadherin的表達降低具有代表性，而snail基因是調節前者表達的關鍵轉錄因子。Raz等[5]報道鼠皮膚癌的侵襲前腳細胞高表達snail，對人類腫瘤研究表明乳腺癌、胃癌、肝癌、結腸癌都高表達snail，并與乳腺癌的組織學分級、淋巴結轉移密切相關。Battle等將反義snail轉染入人結腸癌細胞株HT-29,觀察到細胞株偽足縮短，細胞變園，呈間質細胞樣表型向上皮表型轉化的特征[6]。我們的實驗通過傳代培養口腔鱗癌細胞株證實：不同淋巴結轉移潛能的細胞株細胞外形存在明顯差別，高淋巴結轉移細胞株細胞粘附性差，外形梭形變明顯，低淋巴結轉移細胞株外形圓形比率較高，說明高轉移細胞株的梭形變和粘附力降低是惡性程度增加的形態學基礎，提示參與上皮間質轉換為間質浸潤提供表面分子表型改變。

我們通過對不同淋巴結轉移潛能細胞株12～72 h培養后檢測snail蛋白表達發現，高淋巴結轉移株存在該蛋白的高表達，而低淋巴結轉移組存在該蛋白的低表達，差別具有統計學意義；他人實驗研究還顯示：高表達snail蛋白的細胞株增殖活性較高，且凋亡受到明顯的抑制[7-9]，說明snail蛋白在口腔鱗癌細胞株的表達不僅參與淋巴結轉移，而且與腫瘤細胞的抗凋亡異質性和細胞周期蛋白的表達密切相關。RT-PCR檢測結果顯示：高淋巴結轉移細胞株存在snail基因的高表達，而低淋巴結轉移細胞株存在低表達，說明snail基因的高表達導致細胞免疫表型的改變，惡性程度增加，表型向間質細胞轉化，更具侵襲性，進入淋巴管和血液循環系統的能力增加。

淋巴結轉移過程中涉及的關鍵因子眾多，而上皮間質轉換還包括其他關鍵因子的共同作用，有關的信號通路的研究尚需今后的深入研究，這將有利于探索惡性腫瘤淋巴結轉移發生的奧秘，為進一步治療腫瘤奠定基礎。

1 Mizrahi T,Heller J,Goldenberg S,et al.Zeev Arad Cell Stress Chaperones.The heat shock response in congeneric land snails(Sphincterochila) from different habitats.Cell Stress chaperones,2012,17:639-645.

2 Mizrahi T,Heller J,Goldenberg S,et al.Heat shock proteins and survival strategies in congeneric land snails(Sphincterochila) from different habitats.Cell Stress Chaperones,2012,17:523-527.

3 Hanington PC,Forys MA,Loker ES.A Somatically Diversified Defense Factor,FREP3,Is a Determinant of Snail Resistance to Schistosome Infection.PLoS Negl Trop Dis,2012,6:e1591.

4 Stepan H,Pabst M,Altmann F,et al.O-Glycosylation of snails.Glycoconj J,2012,29:189-198.

5 Raz S,Schwartz NP,Mienis HK,et al.Graham.Fluctuating Helical Asymmetry and Morphology of Snails(Gastropoda) in Divergent Microhabitats at ‘Evolution Canyons I and II’，Israel.PLoS One,2012,7:e41840.

6 Marshall DJ,McQuaid CD.Warming reduces metabolic rate in marine snails: adaptation to fluctuating high temperatures challenges the metabolic theory of ecology.Proc Biol Sci,2011,278:281-288.

7 Howell A,Mugisha L,Davies J,et al.Bovine fasciolosis at increasing altitudes: Parasitological and malacological sampling on the slopes of Mount Elgon.Uganda.Parasit Vectors,2012,5:196.

8 Massobrio P,Giachello G,Ghirardi M,et al.Selective modulation of chemical and electrical synapses of Helix neuronal networks during in vitro development.BMC Neurosci，2013，25：481-485.

9 Nica DV,Bura M,Gergen I,et al.Bioaccumulative and conchological assessment of heavy metal transfer in a soil-plant-snail food chain.Chem Cent J,2012,24：98-104.

Studyontheexpressionofsnailgeneandproteininoralsquamouscellcarcinomacelllineswithdifferentpotentialsoflymphnodemetastasis

SHENYechun,LILiheng,CAIYanxia,etal.TheFirstHospitalAffiliatedtoNorthCollege,Hebei,Zhangjiakou075000,China.

ObjectiveTo investigate the correlation between expression of snail gene and protein and lymph node metastasis in oral squamous cell carcinoma cell line.MethodsThe two cell lines of oral squamous cell carcinoma with higher or lower potential of lymph node metastasis were revived and cultured,and the expression levels of snail gene and protein were detected by flow cytometry and RT-PCR at 12h,24h,36h,48h,60h,72h,respevtively.ResultsThe examination results by flow cytometry showed that the positive expression rate of snail protein in the cell line with higher potential of lymph node metastasis was(48±4)%,which was(20±4)% in the cell line with lower potential of lymph node metastasis,there was a significant difference between the two cell lines(P<0.05).The examination results by RT-PCR showed that overexpression of snail mRNA existed in cell line with higher potential of lymph node metastasis in 6 different time points,however,low-expression of snail mRNA existed in cell line with lower potential of lymph node metastasis,there was a significant difference between the two cell lines(P<0.05).ConclusionThe expression of snail mRNA and protein exists significant differences among oral squamous cell carcinoma cell lines with different potentials of lymph node metastasis,and overexpression of snail gene and protein may be the molecular basis of lymph node metastasis in oral squamous cell carcinoma.

oral squamous cell carcinoma; snail;RT-PCR;flow cytometry; potential of lymph node metastasis

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.11.005

075000 河北省張家口市，河北北方學院附屬第一醫院

R 739.85

A

1002-7386(2014)11-1617-04

2013-12-11)