BQ123對大鼠肢體缺血再灌注后骨骼肌的保護機制

劉燕 彭海兵 王建輝 王銀環 楊秀紅 張連元

·論著·

BQ123對大鼠肢體缺血再灌注后骨骼肌的保護機制

劉燕 彭海兵 王建輝 王銀環 楊秀紅 張連元

目的探討大鼠肢體缺血再灌注(LIR)后骨骼肌細胞損傷變化,以及內皮素A(ETA)受體拮抗劑BQ123對其保護效應的機制。方法雄性Wistar 大鼠隨機分為對照組(雙后肢松弛環繞橡皮圈，不阻斷血流)，LIR組(結扎大鼠雙后肢根部4 h，恢復血流灌注4 h)和BQ123處理組(松帶前15 min給予BQ123 7μg/kg，其他操作同LIR組)，每組8只。檢測肢體缺血4 h再灌注4 h后各組骨骼肌組織中一氧化氮(NO)、內皮素(ET-1)以及NO/ET-1、活性氧(ROS)、髓過氧化物酶(MPO)、Ca2+、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶；采用原位脫氧核糖核甘酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL) 檢測各組腓腸肌細胞的凋亡情況。結果LIR組與對照組相比較，骨骼肌組織NO、ET-1、ROS、 MPO和Ca2+含量均增加，NO/ET-1比值減小，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性降低，凋亡指數(AI)明顯增高(P<0.01)；與LIR組比較，BQ123組骨骼肌組織NO含量升高，ET-1、ROS、MPO和Ca2+含量下降，NO/ET-1比值升高，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性升高，AI下降(P<0.01)。結論BQ123 對大鼠LIR后骨骼肌的保護作用與其拮抗ET-1的作用，改善微循環、減輕氧化損傷、細胞內鈣超載有關。

再灌注損傷；骨骼肌；內皮縮血管肽1

肢體缺血再灌注(limb ischemia reperfusion，LIR)見于交通事故造成的肢體擠壓傷、骨筋膜室綜合征、斷肢再植等。LIR這一常見病理過程不容忽視，其在引起缺血肢體損傷的同時，可進一步導致全身炎性反應和多器官功能障礙[1,2]。由于骨骼肌微血管結構和功能完整是實現骨骼肌再灌注的前提，因此，保護好微血管內皮的結構和功能是防治骨骼肌無復流和再灌注損傷的關鍵措施。內皮素(endothelin,ET)是血管內皮細胞產生的一種內皮收縮因子，ET-1存在ETA和ETB兩種受體。ETA受體參與多種生物學事件，如血管收縮和缺血再灌注炎性損傷反應[3]。BQ123為選擇性ETA受體阻斷劑,本研究利用在體大鼠缺血-再灌注模型，研究BQ123藥物后適應對LIR后骨骼肌損傷的具體保護機制。

1 資料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 10周齡雄性Wistar大鼠24只，體重200～250 g，由河南醫科大學實驗動物中心提供；NO、ROS、MPO、Ca2+、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶試劑盒購于南京建成生物制品公司；ET-1試劑盒購于解放軍總醫院科技開發中心放免所；TUNEL試劑盒購于北京中山生物試劑公司；BO123購于美國Sigma公司。Axiovert 200蔡司光學儀器購于上海,美國產SIGMA-2M/ETM低溫高速離心機。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備與分組:大鼠術前 12 h禁食，自由飲水。將實驗大鼠隨機分為LIR組、BQ123處理組和對照組，每組8只。LIR組：采用止血帶法制作大鼠LIR模型，用橡皮圈環繞結扎大鼠雙后肢根部，并經激光多普勒血流儀監測并證實血流被阻斷,4 h 后松解橡皮帶恢復血流灌注,再經過4 h 后放血處死動物。動物于松解肢體前30 min稱重、麻醉，頸部正中切開皮膚，鈍性分離左側頸靜脈并行靜脈插管。BQ123處理組：操作同LIR組,松帶前15 min經頸靜脈滴注BQ123(7 μg/kg)。LIR組和對照組均于松帶前15 min經頸靜脈滴注0.9%氯化鈉溶液(4 ml/kg)。

1.2.2 骨骼肌組織NO、ET-1、ROS、MPO、Ca2+、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶含量：實驗結束時經腹主動脈放血致死動物后即刻取雙側腓腸肌組織,液氮速凍，-70℃儲藏備用。用扭力天平稱取凍存的骨骼肌組織200 mg，移入裝有2 ml冷0.9%氯化鈉溶液的勻漿管中，冰浴條件下制備骨骼肌組織勻漿。收集上清液采用放免法測定3組ET-1含量，采用生物化學法測定組織NO、ROS、MPO、Ca2+、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶含量。

1.2.3 骨骼肌細胞凋亡檢測：每組隨機腓腸肌放入10 ml/L中性甲醛固定、包埋、切片。采用TUNEL法測定骨骼肌細胞凋亡。采用BI-2000醫學圖像分析系統軟件對腓腸肌組織切片進行分析，每個實驗組分別選取相應切片，高倍鏡下隨機計數1 000個骨骼肌細胞核，平均100個細胞核中呈現陽性反應數目為AI。

2 結果

2.1 骨骼肌組織NO、ET-1、NO/ET-1、ROS和 MPO含量變化 LIR組與對照組比較，骨骼肌組織中NO、ET-1、ROS、MPO均明顯升高，NO/ET-1比值下降(P<0.01)；BQ123組與LIR組比較，ET-1、ROS、MPO明顯降低，但仍高于Control組，NO、升高，NO/ET-1比值升高(P<0.01)。見表1。

表1 3組骨骼肌組織NO、ET-1、NO/ET-1、ROS和MPO變化

組別NO(μmol/L)ET-1(ng/L)NO/ET-1ROS(U/mgprot)MPO(活力單位/克濕片)對照組8.00±1.8326.91±4.810.36±0.02108.20±4.230.51±0.10LIR組11.24±2.13*73.77±8.99*0.17±0.01*158.47±16.12*1.66±0.28*BQ123組13.59±2.07*#43.22±2.59*#0.30±0.03*#126.76±10.40*#1.10±0.19*#

注：與對照組比較，*P<0.05；與LIR組比較，#P<0.01

2.2 3組骨骼肌組織Ca2+、Na+-K+-ATP酶 、Ca2+-ATP酶和凋亡的改變 LIR組與對照組比較，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶含量均明顯降低，Ca2+升高,AI明顯升高(P<0.01)；BQ123組與LIR組比較，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶升高，而Ca2+降低,AI明顯降低(P<0.01)。見表2。

表2 3組骨骼肌組織Ca2+、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和AI變化

組別Ca2+(mmol/gprot)Na+-K+-ATP酶(umolPi/mgprot/hour)Ca2+-ATP酶(μmolPi/mgprot/h)AI對照組0.04±0.011.95±0.282.28±0.342.65±0.37LIR組0.14±0.04*0.84±0.10*1.06±0.16*20.08±2.15*BQ123組0.09±0.02*#1.35±0.25*#1.74±0.32*#14.10±2.30*#

注：與對照組比較，*P<0.01；與LIR組比較，#P<0.01

2.3 骨骼肌組織凋亡情況 TUNEL染色可見陽性的細胞核呈棕黃色，形狀不規整，大小不一致。而正常細胞的細胞核被蘇木素復染呈藍色。見圖1。

3 討論

圖1 3組骨骼肌組織(TUNEL×400)

Na+-K+-ATP 酶和Ca2+-ATP 酶存在細胞膜上，是維持細胞功能正常和離子內環境穩定的基礎。與對照組比較，LIR組骨骼肌組織ATP酶的活性均下降，提示骨骼肌細胞膜受到了損傷。同時，骨骼肌細胞凋亡增加。說明缺血4 h再灌注4 h，骨骼肌組織損傷加重。在LIR這一病理過程中，氧自由基、Ca2+超載、微循環障礙和酸中毒等都可能是破壞骨骼肌細胞、降低ATP酶活力和細胞死亡增加的因素。BQ123是特異性ETA受體阻斷劑，可阻斷ETA受體活性。BQ123組較LIR組ATP酶活性有所提高，骨骼肌細胞凋亡減少，骨骼肌損傷減輕。骨骼肌損傷指標在兩組之間的差別提示BQl23對ET-1介導的大鼠LIR有明顯的保護作用。BQ123幾乎無抑制 ET-1結合ETB受體的作用[4]。有文獻記載ETB受體可以清除循環中的ET[5]。還有報道認為血管內皮細胞的ETB受體激活后可抑制ET分泌，構成ET分泌的負反饋回路[6]。本實驗觀察到BQ123組骨骼肌組織ET-1含量下降，可能與上述兩個原因有關。

ET是體內一類作用強大的內源性血管收縮因子，NO 作為一種血管舒張因子,并參與 ET 的清除。NO/ ET-1比值能說明兩種生物活性物質對機體的作用何種占優勢。趙璞等[7]報道BQ123可增加內皮源性NO產生，最終阻斷ET-1所致的收縮血管平滑肌等作用。本結果顯示,BQ123組較LIR組，NO生成增加，NO/ ET-1升高，明顯抑制了ET-1收縮血管的作用，減輕血管阻力，在一定程度上增大了骨骼肌血液供應。中性粒細胞(PMN)在肢體局部的炎性反應中發揮重要角色，PMN通過“呼吸爆發”釋放大量的氧自由基。ET-1可以對PMN發揮有效的趨化作用，并且這種炎性趨化作用是通過ETA受體進行的。ET-1可能通過刺激提高PMN表面粘附分子的表達來增加PMN的聚集[8]。LIR組MPO 活性的增高，說明組織中PMN數量增加。與對照組比較，LIR 后 4h，骨骼肌組織中ROS明顯增加，提示機體處于氧化應激狀態。有研究表明，一定劑量的BQ123可以有效減少脂多糖誘導自由基生成，提供心肌的抗氧化能力[9]。 BQ123組與LIR組比較，ROS及MPO 活性明顯降低。提示，降低ET-1水平對PMN的聚集及氧自由基的損傷有抑制作用。ET-1 還可激活質膜鈣轉運,刺激肌漿網鈣釋放和細胞內鈣離子通道,增加細胞內鈣離子的釋放[10]。可見，肢體缺血再灌注后，ET-1過度生成可促進Ca2+超載的發生。LIR后4 h，骨骼肌組織中Ca2+明顯增多。應用BQ123后，明顯降低了骨骼肌組織Ca2+含量，這也是其對LIR后骨骼肌的保護機制之一。

綜上所述，ETA受體阻斷劑BQ123對LIR后骨骼肌組織產生保護作用與其拮抗ET-1的作用，改善微循環、減輕氧化損傷、細胞內鈣超載有關。

1 陳燁,周軍,袁婉麗,等.電針預處理對肢體缺血再灌注大鼠生存、腦損傷及認知功能的影響.中國病理生理雜志,2013，29: 469-475.

2 朱娜,張連元,要瑞莉,等.腎上腺髓質素、內皮素-1對大鼠肢體缺血再灌注致心肌損傷的影響.中國現代醫學雜志,2011,21:1331-1334.

3 Jia Y,Zhao Z,Xu M,et al.Prevention of renal ischemia-reperfusion injury by short hairpin RNA of endothelin A receptor in a rat model.Exp Biol Med,2012,237:894-902.

4 Ihara M,Ishikawa K,Fukuroda T,et al.In vitro biological profile of a highly potent novel endothelin(ET) antagonist BQ-123 selective for the ETA receptor.J Cardiovasc Pharmacol,1992,20:S11-14.

5 韓寶石,蓋魯粵.心血管系統內皮素B型受體研究進展.醫學綜述,2008,14:1799-1801.

6 劉寶華，陳惠孫，王代科.內皮素對肝、胃腸的作用研究進展.國外醫學消化系疾病分冊，1997，17:44-46.

7 趙璞,殷桂林,王榮平,等.內皮素-1受體拮抗劑(BQ-123)對大鼠肺缺血-再灌注損傷的保護作用.中華實驗外科雜志,2009,26:1049-1051.

8 Lopez FA,Riesco A,Espinosa G,et al.Effect of endothelin-1 on neutrophil adhesion to endothelial cells and perfused heart.Circulation 1993,88: 1166-1171.

9 Piechota PA，Kleniewska P，Goraca A.The influence of ETA and ETB receptor blockers on LPS-induced oxidative stress and NF-κB signaling pathway in heart.Gen Physiol Biophys,2012,31:271-278.

10 陳敏生,劉世明,羅健東主編.心血管病學前沿-基礎與臨床.第1版.廣州：廣東科技出版社，2009.248-249.

ThemechanismoftheprotectiveeffectofBQ123onskeletalmuscleafterischemiareperfusionofhindlimbsofrats

LIUYan*,PENGHaibing,WANGJianhui*,etal.*BasicMedicineCollegeofHebeiUnitedUniversity,Hebei,Tangshan063000,China

ObjectiveTo observe the injury of skeletal muscle after limbs ischemia reperfusion(LIR) in rats and to investigate the protective mechanism of endothelin-A receptor antagonist BQ123 on the skeletal muscle after LIR.MethodsThe male Wistar rats were randomly divided into three groups,with 8 rats in each group：control group(rubber band around the hind limbs relaxed,without blocking blood flow),LIR group(subjected to 4h of hind limb ischemia and 4h reperfusion),BQ123 treatment group(pretreated with BQ123 7μg/kg 15 minutes before reperfusion).The contents of initric oxide(NO),endothelin-1(ET-1),NO/ET-1,reactive oxygen species(ROS),myeloperoxide(MPO),Ca2+,Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase in skeletal muscle were detected.Apoptosis condition was examined by means of TdT-mediated dUTP nick end labeling(TUNEL).ResultsAs compared with those in control group,the contents of NO,ET-1,ROS,MPO and Ca2+in skeletal muscle tissue were significantly increased in LIR group,however,the levels of NO/ET-1,activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase were decreased,and apoptosis index(AI) was significantly increased(P<0.01).As compared with those in LIR group,the contents of NO were increased,the levels of ET-1,ROS,MPO and Ca2+in skeletal muscle tissue were decreased,the ratio of NO/ET-1 and the activities of Na+-K+-ATPase,Ca2+-ATPase were obviously increased,but AI was significantly decreased in BQ123 treatment group(P<0.01).ConclusionThe protective effect of BQ123 on skeletal muscle of rats after LIR may be related with its effects of antagonizing ET-1,improving microcirculation,alleviating oxidative damage and the calcium overload in cells.

reperfusion injury; skeletal muscle;endothelin-1

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.11.006

項目來源：河北省科學技術研究與發展計劃項目(編號：12277793) 唐山市科技局科研基金資助課題(編號：12140209A-27)

063000 河北省唐山市，河北聯合大學基礎醫學院(劉燕、王建輝、王銀環、楊秀紅、張連元)；河北聯合大學冀唐學院(彭海兵)

R 363

A

1002-7386(2014)11-1620-03

2013-12-22)