急性一氧化碳中毒對大鼠腦血管α-肌動蛋白和β-淀粉樣蛋白的影響

譚清坡 田占坤 趙永芳 王迎霞 王欣 郭文杰 高三花

·論著·

急性一氧化碳中毒對大鼠腦血管α-肌動蛋白和β-淀粉樣蛋白的影響

譚清坡 田占坤 趙永芳 王迎霞 王欣 郭文杰 高三花

目的通過對一氧化碳中毒大鼠腦內小血管壁結構變化的研究，探討一氧化碳中毒后腦組織的血管壁結構的變化規律，可能為闡明遲發性腦病的發病機制提供線索。方法免疫組化和圖像分析法，動態觀察一氧化碳中毒大鼠腦內小血管壁α-肌動蛋白和β-淀粉樣蛋白。結果與對照組相比，急性一氧化碳中毒大鼠的小血管壁中α-肌動蛋白、β-淀粉樣蛋白均有顯著改變(P<0.05)。結論α-肌動蛋白、β-淀粉樣蛋白在一氧化碳中毒大鼠腦組織的血管壁結構變化中起著重要的作用。

一氧化碳中毒；α-肌動蛋白；β-淀粉樣蛋白；大鼠

一氧化碳是生產生活中最常見的化學性窒息性氣體之一[1]。部分一氧化碳中毒患者回復正常或接近正常后，可能表現以癡呆為主的急性精神癥狀，臨床稱為“遲發性腦病”，致死率和致殘率都很高，預后較差。遲發型腦病發病機制尚不十分清楚，腦血管損害是其主要原因。α-肌動蛋白和β-淀粉樣蛋白在血管構建中其重要作用，本研究通過動態觀察CO中毒大鼠腦內α-肌動蛋白、β-淀粉樣蛋白的變化情況，進而研究CO中毒大鼠腦組織血管壁結構的變化規律，以期為遲發性腦病的發病機制提供依據。

1 資料與方法

1.1 儀器與藥品 光學顯微鏡，日本OLYMPUS BX51T-PHD-J11；電子透射顯微鏡，德國JEM-2000Ex；多功能彩色圖像分析系統，美國Image-Pro Plus6.0。α-肌動蛋白抗體、β淀粉樣蛋白抗體、免疫組化試劑盒均購自武漢博士德生物公司。99.9%CO氣體(市售)。

1.2 動物及分組 清潔級健康SD大鼠108只，雄性，體重180～220 g，河北省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(冀) 2008-1-003。實驗前1周適應性飼養，自由進食飲水。動物隨機等分為空氣對照組和染毒組，每組按時間點各設9個亞組：6 h、1 d、2 d、3 d、4 d、7 d、14 d、21 d、28 d，每個亞組6只大鼠。

1.3 標本制備及免疫組化檢測 單次腹腔注射式染毒法建立CO中毒大鼠模型，對照組腹腔注射等量空氣[2]。動物經10%水合氯醛(300 mg/kg，腹腔注射)麻醉后，打開胸腔，行左心室灌流，4%多聚甲醛固定。依各個時間點灌注、固定后取蒼白球區腦組織置恒冷切片機中連續切片，切片厚20 μm。腦片經水化、抗原修復，分別加入α-肌動蛋白(1∶100)、β淀粉樣蛋白(1∶200)。按試劑盒操作說明，依次加入生物素標記的二抗、三抗，DAB顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明、封片。檢測不同時間點α-肌動蛋白、β-淀粉樣蛋白的表達情況。

1.4 圖像分析 采用美國Imagepro-Plus 6.0軟件圖像分析系統，高倍鏡下( 10 × 20) 每張切片分別選取外徑相近、圓整小動脈各5個，測定測試區域陽性產物的灰度值(GA)和面積(n)及背景的灰度值(GB)和背景面積(m)。利用免疫組化定量計算公式：PU=|GA-GB|/Aα×Gmax×100，計算陽性單位(PU)值。Aα為陽性產物在所選區域中的面積密度，Aα=n/(m+n)；Gmax為圖像分析系統的最大灰度分級，為256。

2 結果

2.1 大鼠CO中毒后α-肌動蛋白變化 對照組血管壁上可見α-肌動蛋白陽性表達，不同時間點表達情況未見明顯變化。染毒組亦可見α-肌動蛋白表達，PU值先低后高呈V型變化，2 d時PU值表達最低，顯著低于同期對照組(P<0.05)，21 d時PU值表達最高，顯著高于對照組(P<0.01)。見表1。

表1 CO染毒大鼠腦組織血管α-肌動蛋白PU值表達變化比較

組別PU值6h1d2d3d4d7d14d21d28d對照組24.1±3.424.4±3.024.8±2.824.4±4.024.4±4.023.9±3.224.3±3.324.6±3.124.5±3.6染毒組22.7±3.221.9±2.020.8±3.2*22.8±3.423.1±3.225.8±3.026.9±3.532.6±3.2#32.0±3.6#

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01，

2.2 大鼠CO中毒后β-淀粉樣蛋白變化 對照組各個時間點血管壁均無陽性表達。染毒組3 d后β-淀粉樣蛋白表達顯著增高，中期達峰值。與對照組相比，中毒組3～21 d β-淀粉樣蛋白表達顯著增高(P<0.05)，至28 d時β-淀粉樣蛋白表達呈陰性。見圖1～3。

圖1 染毒組β-淀粉樣蛋白PU值表達變化

圖2 對照組14 d β-淀粉樣蛋白(HE×400) 圖3 染毒組14 d β-淀粉樣蛋白(HE×400)

3 討論

血管由外膜、中膜和內膜構成，中膜平滑肌細胞是構成血管壁的主要細胞，在血管活性和血管壁重構中發揮重要作用。平滑肌細胞表達增多及表型的改變，導致多種心腦血管疾病的發生。α-肌動蛋白被認為是平滑肌細胞表型轉化的標志物，正常生理條件下，平滑肌細胞體積較小，α-肌動蛋白含量較多；病理改變時，細胞向合成型轉變，細胞體積增大，分泌增殖能力增強，α-肌動蛋白含量減少。本研究以α-肌動蛋白為指標，觀察了CO中毒大鼠小動脈平滑肌細胞α-肌動蛋白表達情況，研究發現，作為平滑肌增殖分化標志之一的α-肌動蛋白染毒后2 d達到最低點，并逐漸增大至

第21天達到高峰。結果表明在CO中毒初期，由于缺血缺氧等刺激因素，平滑肌細胞增殖分泌增加，表現出向合成型轉變，后期隨著損傷因素的緩解，增殖增生可得到緩解，細胞恢復為收縮型。

β-淀粉樣蛋白表達異常表達會導致阿爾茨海默病的的發生發展[3，4]。新的研究表明，在腦缺血的損傷過程也表現出β-淀粉樣蛋白表達異常。研究發現，腦缺血缺氧可以通過多種途徑影響腦內β-淀粉樣蛋白的生成和清除機制，導致β-淀粉樣蛋白在腦內異常增多；慢性缺氧可導致β-淀粉樣蛋白的生成增加[5，6]。β-淀粉樣蛋白表達增多，可導致淀粉樣血管病和阿爾茨海默病。CO中毒早期β-淀粉樣蛋白的出現，可能是與缺氧導致β-淀粉樣蛋白的生成及清除機制失衡有關。隨著大腦清除β-淀粉樣蛋白機制的恢復，β-淀粉樣蛋白逐漸減少直至消失。本研究首次發現β-淀粉樣蛋白在CO中毒大鼠腦組織的異常表達，且表達峰值出現在染毒后7～14 d，與遲發型腦病的“假愈期”相吻合，提示β-淀粉樣蛋白的異常沉積可能是導致與遲發型腦病發生發展的原因之一。

1 Raub JA,Mathieu Nolf M,Ham P NB,et al.Carbon monoxide a public health perspective.Toxicology,2000,145:1-14.

2 王蘇平,田占坤,王曉虹,等.急性一氧化碳中毒大鼠腦內小血管壁結構的變化.中風與神經疾病雜志,2012,29:343-345.

3 Vardy ER,Catto AJ,Hooper NM.Proteolytic emeehanisms inamyloid- beta metabolism: therapeutic implications for Alzheimer’s disease.Trends Mol Med，2005， 11: 464- 472.

4 Yamaguchi H,Yamazaki T,Lemere CA,et al.β- amyloid is focally deposited within the outer basement membrane in the amyloid angiopathy of Alzheimer＇s disease.An immunoelectron microsco pic study.AM J Pathol，1992,141:249-259.

5 Effect of hypoxia/ischemia and hypoxic preconditioning/reperfusion on expression of some amyloid-degrading enzymes.Ann N Y Acad Sci，2004，1035:21-33.

6 鄭瑩，閆福嶺.腦缺血對腦內β-淀粉樣蛋白清除的影響.中國腦血管病雜志，2007,4:186-190.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.11.015

061036 河北省滄州市，中國人民解放軍空軍95809部隊醫院(譚清坡)；河北省任丘市人民醫院內三科(田占坤、趙永芳、王迎霞、王欣、郭文杰)，中西醫結合科(高三花)

田占坤，060000 河北省任丘市人民醫院； E-mail:tianxia.643@163.com

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1002-7386(2014)11-1643-02

2013-12-11)