外周血調節性T細胞表達水平與卵巢上皮癌預后的相關性

趙春梅

(河北省保定市第二中心醫院, 河北 保定, 072750)

卵巢上皮癌(EOC)是最常見的婦科惡性腫瘤之一[1]，其常規治療手段包括原位切除及術后放化療。盡管許多患者在常規治療后，其腹水癥狀可得到緩解，但大多數患者會出現復發情況，因而目前EOC逐漸成為致死率最高的婦科腫瘤之一。許多研究[2]證實，調節性T細胞(Tregs)能夠下調非特異性免疫水平，促進腫瘤發展，對于患者的治療和康復有不良影響。有研究[3]認為FoxP3+ Tregs對于EOC的預后有影響，但大多相關研究是通過病理切片或實驗進行研究，缺乏臨床研究，目前只明確在部分EOC病理過程中可能發生卵巢Tregs原位積累[4]，但有關外周血Tregs與EOC的關系則并未明晰。本研究選取2010年1月—2013年6月本院收治的卵巢癌患者50例，對比治療前后外周血Tregs水平，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月—2013年6月本院收治的卵巢癌患者50例，平均年齡(55.7+7.33)歲，均經影像學檢查及病理活檢確診為EOC，癌癥分期根據國際抗癌聯盟(UICC)2002年修訂的TNM分期標準，其中Ⅰ、Ⅱ期患者24例為Z組，Ⅲ、Ⅳ期患者26例W組。所有患者術前均無免疫抑制劑使用、圍術期輸血史、自身免疫性疾病、6個月內未接受抗腫瘤化療及免疫調節治療。所有患者均知情且同意接受術后外周血Tregs檢測。

1.2 治療方法

所有患者均因故不能接受手術治療，并接受聯合化療：阿霉素40～50 mg/kg與環磷酰胺500 mg/kg, 靜注后間隔4周為一個療程。血液樣本采集患者治療前及治療6個療程后清晨空腹外周靜脈血，樣本含量均為5 mL, 經抗凝處理后即行檢驗。人調節性T細胞檢測試劑盒(Human Regulatory T cell Staining Kit)購自美國ebioscience公司，檢測用流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司，型號為MoFlo XDP。對所得血液樣本按照生產商提供的步驟進行預處理后使用流式細胞儀進行檢測，具體步驟如下：取抗凝混勻的全血100 μL加入流式上樣管，分別加入抗cD4-FITC 10 μL和抗CD25-PE 10 μL，室溫下孵育30 min, 后裂解紅細胞。向上樣管內加入破膜/固定劑1 mL, 4 ℃避光孵育40 min。洗滌細胞后加入鼠血清4 ℃避光15 min, 加入抗Foxp3-PE～Cy5及IgG2a-PE-Cy5同型對照, 4 ℃避光孵育30 min, 洗滌后多聚甲醛重懸細胞，通過流式細胞術檢測并分析。記錄外周血Tregs占CD4+T細胞的比例。治療后隨訪6個月，記錄患者復發情況并進行比較。

1.3 統計學分析

數據以均數+標準差表示，用SPSS 19.0軟件包進行統計學分析。組間均數的比較采用獨立樣本t檢驗及χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

聯合化療6個療程后，臨床控制率100%。測得Z組患者治療前外周血Tregs表達頻數平均數為(17.32±7.68)%, 明顯低于W組的治療前頻數平均數(25.67±11.05)%(P<0.05), 治療后Z組依然明顯低于W組(P<0.05), 且2組治療前后外周血Tregs表達頻數平均數均呈現治療后較治療前明顯降低的趨勢(P<0.05)。治療后半年內Z組復發7例，W組復發17例，Z組復發率明顯低于W組(χ2=6.56,P<0.05)。見表1。

表1 2組患者外周血Tregs表達頻數比較

3 討 論

EOC是世界范圍內女性致死率第五位的惡性腫瘤，其早期癥狀不明顯及高復發率是導致這一結果的主要原因[1]。一般認為EOC的發生來源于外部致癌物質以及體內激素調節機制紊亂。然而隨著對EOC認識的深入，人們逐漸意識到腫瘤微環境對于EOC各期的發生和發展有重要影響，其中免疫系統對于EOC的影響尤為突出[5]。無論是原發還是復發EOC，均可發現免疫促進體系與免疫抑制體系間的微妙平衡對腫瘤生長起重要作用[6]。生理情況下卵巢、子宮及附件組織間隙內存在著數量可觀的CD8+T細胞、NK細胞、NKT細胞，這些細胞構成的非特異性免疫微環境被認為是影響腫瘤發生發展的重要環節，且有跡象表明其受到外周血Tregs的調控[7-9]。Tregs是一類表達IL-2受體α鏈的活化T細胞的集合，這類細胞在自體免疫抑制和外周耐受中起主要作用，由于CD4+/CD25+調節性T細胞是這類細胞中發揮重要作用者和主要研究對象，因而作為一般研究對象即將其定義為Tregs[10]。由于其對于T細胞的發育和功能具有關鍵作用，而非特異性免疫在腫瘤免疫抑制的建立與維持過程中具有重要作用，因而Tregs與腫瘤的關系也成了當前的研究熱點。Tregs介導的免疫抑制是腫瘤細胞逃避免疫監視的主要機制和針對腫瘤免疫治療失敗的主要原因[11-13]。Tregs在EOC中的作用較健康人的功能有所不同，有報道[14]稱正常情況下Tregs在無血清培養基中無法抑制CD4+、CD25+T細胞，而EOC患者Tregs則可以抑制，因而在EOC中Tregs的免疫抑制性可能得到了增強。另有研究[15]表明Tregs能夠抑制T細胞應對Tregs抑制的敏感性及應激能力。越來越多的研究[16-17]表明, Tregs能夠影響侵及器官內包括非特異性免疫和特異性免疫在內的整個腫瘤微環境，使得器官內免疫耐受增強，使得體內腫瘤相關免疫功能受到抑制，這一變化可能為EOC的發生創造有利條件。因而，外周血Tregs的表達水平可能直接反映EOC的病理進程，其可作為評估EOC病情及預后的重要標志物。本研究通過臨床研究部分證實了上述假設，通過比較治療前后外周血Tregs表達水平發現，病情處于較為初期的Ⅰ、Ⅱ期患者，其外周血Tregs表達水平明顯低于中末期的Ⅲ、Ⅳ期患者，這說明外周血Tregs表達水平在一定程度上隨EOC病情發展升高，證實了之前報道所稱EOC發生發展與Tregs的密切關系，也進一步理清了其相關關系。通過治療, 2組患者病情均得到臨床控制，但其外周血Tregs表達水平依然存在與治療前相似的關系，這說明外周血Tregs表達水平可以反映更深層次的病理情況，即便均得到臨床控制，但Z組患者外周血Tregs表達水平低于W組患者，說明其病情仍有差異。這一差異在隨訪過程中復發情況得到了部分反映，治療結束后6個月內，Z組患者復發率明顯低于W組患者，這說明外周血Tregs表達水平與EOC復發具有密切相關性。有報道[18-20]稱在子宮內膜癌、卵巢癌、直結腸癌等病例中也觀察到相似情況，但目前對于這一相關性的具體機制尚不明晰。

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