自噬和凋亡聯合在ALA-PDT誘導C6膠質瘤細胞死亡中的作用機制

肖 虹

(重慶市急救醫療中心 神經外科, 重慶, 400014)

作者以前的研究表明光敏劑ALA誘導的光化學反應有抗腫瘤活性。自噬(也稱為Ⅱ型程序性細胞死亡)和Ⅰ型程序性細胞死亡共享一些監管因素和相互參與腫瘤發生[1-3]。自噬活性與腫瘤的分化狀態相關，惡變通常發生自噬活性的抑制。有研究[4]發現在腫瘤細胞的各種抗腫瘤劑的作用涉及到自噬性細胞死亡。光動力療法(PDT)是被批準用于治療癌性疾病和非腫瘤性疾病的微創治療方法。本研究探討自噬和凋亡在ALA- PDT誘導C6膠質瘤細胞死亡中的聯合作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養和ALA- PDT

C6膠質瘤細胞由西南醫院病理研究所提供。細胞培養在在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基(37 ℃, 5% CO2溫育)。C6膠質瘤細胞接種于6孔板中，并培養24 h, ALA(100, 200, 400, 800, 1 600 μg/mL)的溶液中加入到培養基中和PDT(波長為635 nm, 200 W/cm2的強度及5 min的照射時間)。對細胞進行標記(monodansylcardeverine)(MDC)或固定電鏡檢查。C6膠質瘤細胞(用400 μg/mL的ALA-PDT 1～24 h)收獲提取總蛋白，以確定胱天蛋白酶活化對ALA-PDT誘導的C6神經膠質瘤細胞死亡的機制。

1.2 檢測細胞自噬MDC熒光染色

檢測autophagicvacuoles(AV)的是基于Biederbick等[5]的方法進行。細胞培養物被卸載并用PBS沖洗2次，以除去含血清培養基中。然后，經過孵育的MDC在0.05 mmol/L, 在37 ℃ 60 min, 將細胞浸泡在4%多聚甲醛中15 min后，用PBS沖洗2次，并在露天干燥。最后，將細胞通過使用熒光顯微鏡與356 nm的發射濾片和545 nm處擊穿過濾盤進行觀察和拍照。

1.3 透射電子顯微鏡檢查

將細胞固定于冰冷的2.5%戊二醛的0.1 M磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，并于4 ℃中進一步的處理保持不變。當處理重新開始，細胞后固定在1%四氧化鋨在同一緩沖液中，脫水，分級醇，切片用超薄切片機，蘸上醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛后接著用透射電子顯微鏡檢查。

1.4 Western印跡

C6膠質瘤細胞行ALA-PDT (波長為635 nm, 200 W/cm2的強度及5 min射時間)培養在6孔培養板中與ALA(400 μg/mL)處理后，對細胞貼壁和浮收集細胞，冷凍在-80 ℃ 。將細胞沉淀物重新懸浮按照Western Blotting方法凝膠成像顯影分析結果。

1.5 統計學分析

采用SPSS 13.0數據處理軟件包進行數據處理，數據以均數±標準差表示，對數據進行獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ALA-PDT誘導C6膠質瘤細胞自噬活化現象的觀察

本實驗中所使用的MDC是一種特異性自噬標記物，它可被細胞吸收并選擇性地聚集于自噬囊泡(AVs)中，用熒光顯微鏡可觀察到染上MDC熒光的AVs呈點狀結構，散布于胞漿及核周，因此可根據細胞內熒光顆粒的變化來形象地檢測推斷自噬的活化。實驗結果顯示，ALA-PDT(400 μg/mL)3 h后，即可見明顯的點狀熒光顆粒散布于C6膠質瘤細胞的胞漿內，照射后6、12 h處理組熒光顆粒更加明顯，照射后24 h熒光顆粒變得很弱，而對照組很少有熒光顆粒的分布。提示400 μg/mL的ALA-PDT 3 h后即有大量自噬囊泡出現，并持續至照射24 h。表明PDT后3 h可誘導C6膠質瘤細胞發生自噬，形成自噬囊泡; PDT后6～12 h, 細胞內自噬大量活化，自噬囊泡數目增多。對照組無明顯自噬現象出現。見圖1。

圖1 MDC自噬特異染色觀察ALA-PDT后3h C6膠質瘤細胞自噬泡的變化情況 左圖為普通光源;右圖為熒光

2.2 透射電鏡觀察細胞超微結構

由于透射電鏡可形象地觀察到獨立雙層膜、自噬體等自噬過程中各形態的變化，直至今日，電鏡仍是國內外普遍認可的最為可靠的自噬檢測手段。本實驗在ALA-PDT后各時間點制作成普通電鏡標本，透射電鏡下觀察C6細胞超微結構的改變：陰性對照組C6膠質瘤細胞胞漿內細胞核、各細胞器、染色體形態和分布均正常。而ALA-PDT(400 μg/mL)后3 h, 胞漿中即出現大量獨立雙層膜結構，甚至彎曲呈同心圓，部分區域形成大量雙層及多層膜結構的自噬體(圖2 A、B)。ALA-PDT 12～24 h, 透射電鏡下可以觀察到大部分細胞呈現典型的凋亡樣改變：細胞體積縮小，細胞膜表面微絨毛消失，胞漿濃縮、染色深，胞漿內可見細胞器空泡樣變及由線粒體退行性變形成的髓鞘結構，胞核縮小，染色質邊聚，有些呈現新月形改變，細胞膜上有大小不等的突起，凋亡小體形成等(圖2C); 同時胞質內一些溶酶體染色加深，出現了大量自噬溶酶體(圖2D)。

圖2 ALA-PDT后6 h C6膠質瘤細胞超微結構

2.3 ALA-PDT對C6膠質瘤細胞溶酶體酶Caspase-3蛋白表達的影響

PDT后1 h C6膠質瘤細胞內即有少量Caspase-3被活化，之后活性片段的水平降低，照射12 h后活性片段最多，此時Caspase-3酶原表達也增高。若在ALA-PDT前30 min加入Caspase-3特異抑制劑Ac-DEVD-CHO，則可見活化Caspase-3酶原活化明顯減弱, 與ALA-PDT組比較具有顯著性差異(P<0.05)。見圖3-4。

3 討 論

與Pro-caspase-3組比較，*P<0.05

PDT是一種有較高特異性的治療惡性腫瘤方法，PDT后腫瘤細胞的死亡途徑及其機制一直是研究的熱點。光敏劑的種類及光敏劑在細胞內部的亞分布等都是影響腫瘤細胞死亡途徑的因素[6]。近年來，自噬與惡性膠質瘤的關系逐漸被人們重視，臨床的研究也證實惡性膠質瘤細胞對促凋亡的放化療藥物明顯耐受，而對促自噬作用的藥物如替莫唑胺卻很敏感，可見自噬與惡性膠質瘤的發生發展有密切關系。作者實驗發現ALA-PDT可誘導C6膠質瘤細胞自噬的發生。但自噬對促進腫瘤和抑制腫瘤均有作用，Jia等[7]認為自噬的早期階段是某些細胞發生凋亡所必需的。自噬抑制劑3-MA預處理阻斷自噬后, C6膠質瘤細胞生存率在PDT早期(1～3 h)顯著降低，后期下降不明顯，表明自噬在ALA-PDT照射早期對受損細胞器(如溶酶體等)及時隔離、清除具有一定作用，若阻斷自噬將去除細胞的自我保護作用，細胞存活率減少。結合PDT后12 h電鏡下所見大量細胞空泡化，可推斷隨著胞內細胞器的進一步損傷，促凋亡因子的大量釋放以及死亡信號級聯反應的放大，細胞的破壞程度超過了自噬的保護能力，自噬性程序性細胞死亡被啟動，并與凋亡共同促進細胞走向滅亡。由此可見，自噬對PDT后C6膠質瘤細胞的保護作用僅體現為延遲細胞死亡的發生，最終是與凋亡發生協同作用促進C6膠質瘤細胞死亡，起到ALA-PDT的殺傷腫瘤細胞的效應。C6膠質瘤細胞在ALA-PDT后誘導自噬與凋亡發生，二者可能同時受到某一中心細胞器的調控，處于動態變化之中。例如溶酶體可以作為整合和傳達各種信號、聯系和激活自噬與凋亡途徑的紐帶[8]。自噬發生到最終階段，自噬體的外層膜可與溶酶體膜發生融合，從而釋放內層膜囊泡即自噬小體進入溶酶體內發生降解。MDC染色、電鏡結果已顯示，自噬參與了ALA-PDT誘導的C6膠質瘤細胞的死亡過程，而細胞內溶酶體酶的活性極有可能與之有關。自噬與凋亡在溶酶體的整合調控下處于動態變化之中，兩者在細胞死亡中所起的作用受信號傳導通路中某些關鍵因子的影響[9]。在C6膠質瘤細胞中, ALA-PDT導致自噬泡形成后Caspase酶原的大量釋放誘導了自噬和凋亡發生。本實驗中Caspase 3在ALA-PDT后即開始表達增加，用自噬抑制劑3MA和Ac-DEVD-CHO干擾后表達量均有所下降，結合在用MDC對AVs進行熒光染色的實驗中發現，C6膠質瘤細胞在PDT后1 h未見明顯包含自噬泡的熒光顆粒出現[10-12]; 電鏡下觀察，凋亡形態的出現(照射后6 h)晚于自噬的活化(照射3 h)的情況，說明自噬在C6膠質瘤細胞損傷的早期及時清除受損細胞器，可能抑制Caspase活化途徑，在一定程度上延遲甚至拮抗了凋亡；但自噬在細胞死亡中扮演的角色并不是一成不變的，如果胞內細胞器進一步遭到破壞以及促凋亡因子的大量釋放超過了自噬的承受范圍，自噬轉變為細胞死亡誘因，自噬性死亡、凋亡甚至壞死將共同促進細胞走向滅亡。ALA-PDT后1 h, C6膠質瘤細胞中Caspase-3輕度活化，照射后12 h的Caspase-3大量活化，且酶原表達增高;而用Ac-DEVD-CHO預先處理時，Caspase-3的活化明顯減弱[13-14]。自噬與凋亡所處地位不同，由于C6膠質瘤細胞中完整的Caspase級聯放大體系，使得凋亡在細胞死亡中處于主導地位，自噬誘導細胞死亡的作用被掩蓋，而其保護細胞的功能顯現出來。

與Actived-caspase-3組比較，*P<0.05

綜上所述，細胞內各種死亡途徑并不是獨立存在的，而是在某些關鍵環節由一些中心因子共同調控著。目前對自噬與凋亡之間的關系還不清楚，但已肯定兩者間的相互獨立是相對的，相互聯系是絕對的。自噬與凋亡是ALA-PDT作用下C6膠質瘤細胞內自噬體大量形成、溶酶體酶大量釋放及Caspase級聯放大反應的結果。ALA-PDT早期，自噬延遲了Caspase依賴的凋亡發生，對腫瘤細胞具有保護作用。但有研究證實惡性膠質瘤細胞對促凋亡機制耐受，但卻對促自噬作用敏感，誘導腦膠質瘤細胞發生自噬，可能是成功治療腦膠質瘤的重要突破口[15-16]。如替莫唑胺作為目前臨床最有效的抗膠質瘤藥就是通過破壞了以mTOR信號控制路徑促進膠質瘤細胞發生自噬過程達到細胞毒性作用。隨著對各種抗癌治療機制研究的深入，對自噬與凋亡的相互關系及其分子機制，自噬在細胞死亡中角色的改變，自噬、溶酶體酶與Caspase依賴和非依賴的凋亡、程序性壞死之間相互作用的調控機制將得到進一步的了解，人們可特異性地誘導腫瘤細胞發生自噬，為在腫瘤治療中提供新思路。

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