線粒體分裂蛋白抑制劑對匹魯卡品致癇大鼠海馬神經元的保護作用*

張 倩，張宏偉，夏建華，連亞軍，謝南昌

1)鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052 2)河南省人民醫院康馨綜合病房 鄭州 450003 3)中國平煤神馬醫療集團總醫院神經內科 平頂山 467100 4)駐馬店市中心醫院神經內科 駐馬店 463000

線粒體分裂蛋白抑制劑對匹魯卡品致癇大鼠海馬神經元的保護作用*

張 倩1,2)，張宏偉1,3)，夏建華1,4)，連亞軍1)#，謝南昌1)#

1)鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052 2)河南省人民醫院康馨綜合病房 鄭州 450003 3)中國平煤神馬醫療集團總醫院神經內科 平頂山 467100 4)駐馬店市中心醫院神經內科 駐馬店 463000

#通訊作者，連亞軍，女，1964年4月生，博士，主任醫師，教授，研究方向：癲癇、頭痛、腦血管病、肌張力障礙的基礎與臨床，E-mail：yajunlian@163.com；謝南昌，男，1984年1月生，博士，主治醫師，研究方向：癲癇的基礎與臨床， E-mail：hnxienanchang@163.com

癲癇；線粒體分裂；Mdivi-1；氧化應激；凋亡

目的：研究線粒體分裂蛋白抑制劑(Mdivi-1)對匹魯卡品(PILO)致癇大鼠海馬神經元的保護作用及其機制。方法121只雄性SD大鼠隨機分成對照(CON)組、PILO組、PILO+DMSO組和PILO+Mdivi-1組，PILO組又分為癲癇持續狀態(SE)2 h、8 h、24 h和72 h 4個亞組。觀察各組大鼠行為學改變，并分別采用Nissl染色法檢測神經元損傷，比色法檢測SOD活力及MDA含量，Western blot和RT-PCR法檢測Drp1、細胞色素C(Cyt C)、凋亡誘導因子(AIF)和cleaved-半胱天冬酶3(caspase-3)表達水平。結果與PILO組(114.571±5.420)相比，PILO+Mdivi-1組海馬神經元數目增加[(157.429±6.183);F=68.693，P<0.001]。與PILO組SE 24 h亞組[(113.429±4.980)，(6.102±0.193) ]相比，PILO+Mdivi-1組SOD活力增加[(138.571±3.380);F=21.779，P<0.001]，MDA含量減少[(4.353±0.231);F=27.226，P<0.001]。與PILO組[(0.594±0.020)，(1.099±0.015) ]相比，PILO+Mdivi-1組線粒體Cyt C增加[(0.897±0.015);F=296.177，P<0.001]，細胞質Cyt C減少[(0.433±0.010);F=562.684，P<0.001]。與PILO組[(0.878±0.037)，(1.465±0.076)] 相比，PILO+Mdivi-1組線粒體AIF增加[(1.279±0.051);F=59.298，P<0.001]，細胞核AIF減少[(0.896±0.044);F=46.424，P<0.001]。與PILO組(0.587±0.192) 相比，PILO+Mdivi-1組cleaved caspase-3減少[(0.463±0.022);F=40.500，P<0.001]。結論Mdivi-1對癲癇大鼠海馬神經元有保護作用，其機制可能與降低氧化應激，抑制Cyt C釋放、AIF移位及caspase-3激活有關。

癲癇是臨床上最常見的神經系統疾病之一，全球大約有5 000萬人患病。長期、反復的癲癇發作嚴重降低了患者的生活質量，因而明確癲癇的發病機制及尋求新的治療方法具有重要的現實意義。癲癇發作可使線粒體功能受損，導致線粒體膜電位降低，線粒體發生通透性轉運，細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)及凋亡誘導因子(apoptosis-inducing factor，AIF)釋放入胞質，引起細胞凋亡，導致神經元對癇性損傷更敏感，形成惡性循環[1-2]。動力相關蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)是線粒體分裂調控關鍵蛋白，主要位于細胞質，受線粒體外膜分子Fis1的招募而轉位至線粒體潛在分裂位點，形成指環結構，逐漸壓縮直至線粒體分裂。線粒體分裂后，Drp1重新回到胞質，如此循環反復[3]。線粒體分裂蛋白抑制劑(mitochondrial division inhibitor，Mdivi-1)是一種喹唑酮類衍生物，通過抑制GTP酶的活性來發揮抑制Drp1的作用[4]。已有文獻報道Mdivi-1可減輕心肌缺血再灌注損傷[5]和急性腎損傷中的細胞凋亡[6]，但尚未見有關Mdivi-1在癲癇模型中作用及機制的相關報道。該研究通過Mdivi-1預處理，觀察其對匹魯卡品(pilocarpine，PILO)致癇大鼠行為學及海馬神經元損傷的影響，并檢測氧化應激指標MDA、SOD及凋亡相關分子AIF、Cyt C及Caspase-3的變化，以進一步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物121只健康成年雄性SD大鼠，體重200～250 g[由鄭州大學實驗動物中心提供，許可證號SCXK(豫)2010-0002]，采用隨機數字表法分為CON組、PILO組、PILO+DMSO組和PILO+Mdivi-1組4組，其中PILO組又分為癲癇持續狀態(status epilepticus，SE)2 h、8 h、24 h和72 h 4個亞組，除PILO組的SE 2 h、8 h和24 h 3個亞組每組11只外，其余各組每組22只。

1.2實驗試劑氯化鋰、PILO和DMSO均購自美國Sigma公司；Mdivi-1購自ENZO公司。MDA和SOD檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、全蛋白提取試劑盒、線粒體蛋白提取試劑盒及細胞核和胞質蛋白提取試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司。兔抗大鼠Drp1、Cyt C多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗大鼠AIF、caspase-3多克隆抗體購自英國Abcam公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG購自北京晶美生物工程有限公司，PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，Trizol RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司，Prime Script RT-PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3癲癇模型及藥物干預模型建立SD大鼠腹腔注射氯化鋰(127 mg/kg)進行預處理，20 h后腹腔注射PILO(30 mg/kg)，在注射PILO前30 min給予皮下注射氫溴酸東莨菪堿(1 mg/kg)以拮抗PILO的外周膽堿能反應。PILO+Mdivi-1組和PILO+DMSO組在注射PILO前30 min分別給予腹腔注射Mdivi-1(1.2 mg/kg)或體積分數0.1% DMSO。對照組用等體積的生理鹽水代替PILO。SE維持60 min后腹腔注射地西泮(10 mg/kg)終止發作。

1.4大鼠行為學觀察以參考文獻[7]為判定標準，達到Ⅳ或Ⅴ級定為癲癇模型制作成功。分別記錄各組大鼠致癇成功率及潛伏期。

1.5取材、檢測指標及方法PILO組、PILO+DMSO組和PILO+Mdivi-1組在造模成功后72 h各取6只大鼠，CON組在腹腔注射地西泮后72 h取6只大鼠，分別給予腹腔注射水合氯醛(100 mg/kg)麻醉，仰臥固定于解剖板，充分暴露心臟，先用生理鹽水快速灌注，后用40 g/L多聚甲醛緩慢推注，灌注完成后開顱取腦，將腦組織放于40 g/L多聚甲醛中于4 ℃冰箱固定24 h后進行Nissl染色。PILO組SE 2 h、SE 8 h、SE 24 h和SE 72 h亞組分別在造模成功后2、8、24和72 h各取8只大鼠，PILO+DMSO組和PILO+Mdivi-1組在造模成功后24 h各取8只大鼠，CON組在腹腔注射地西泮后24 h取8只大鼠，水合氯醛麻醉后處死并迅速取出腦組織，于低溫修塊臺上分離出雙側海馬，置于-80 ℃保存用于MDA、SOD、Western blot和RT-PCR檢測。

1.5.1 Nissl檢測 在大腦視交叉與視乳頭之間冠狀切取厚3 mm組織，脫水后石蠟包埋，制備厚度為10 μm的連續切片，甲苯胺藍染色，顯微鏡下觀察大鼠海馬CA3區神經元損傷和丟失情況。

1.5.2 MDA、SOD的檢測 取海馬組織稱重，按組織與生理鹽水1:9(質量比)的比例置于玻璃勻漿器中冰浴研磨，離心，取上清液，檢測海馬組織中MDA含量和SOD活力[8]。

1.6各組大鼠海馬組織中CytC、AIF及cleavedcaspase-3蛋白表達的Westernblot檢測分別提取海馬組織全蛋白、細胞質蛋白、線粒體蛋白和細胞核蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳后轉膜，封閉2 h。一抗孵育，加入兔抗大鼠Drp1(按1:2 000稀釋)、Cyt C(線粒體蛋白、細胞質蛋白，按1:3 000稀釋)、AIF(線粒體蛋白、細胞核蛋白，按1:300稀釋)、caspase-3(按1:300稀釋)多克隆抗體，置于4 ℃冰箱過夜。洗膜后加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(按1:10 000稀釋)，室溫反應1 h，ECL顯影成像，重復3次。采用凝膠成像分析系統測定條帶光密度，以目的蛋白與相應內參條帶(β-actin、cox-Ⅳ、β-actin、cox-Ⅳ及β-actin、Histone及β-actin)光密度比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.7各組大鼠海馬組織中Drp1mRNA表達的RT-PCR檢測參照Trizol RNA提取試劑盒說明提取大鼠海馬組織總RNA，紫外分光光度儀測量RNA濃度。用Prime Script RT-PCR試劑盒逆轉錄合成cDNA，以此為模板進行PCR擴增。Drp1上游引物序列5’-CGTAGTGGGAACTCAGAGCA-3’， 下游引物序列3’-TGGACCAGCTGCAGAATAAG-3’，擴增產物大小為120 bp；內參GAPDH上游引物序列5’-CCT TCATTGACCTCAACTAC-3’， 下游引物序列3’-GGAAGGCCATGCCAGTGAGC-3’， 擴增產物大小為536 bp。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環；再72 ℃延伸7 min。15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射分析儀觀察結果，實驗重復3次。采用凝膠成像分析系統測定條帶光密度，以Drp1與內參條帶光密度比值作為Drp1 mRNA的相對表達量。

1.8統計學處理采用SPSS 17.0進行分析，應用精確概率法比較各組大鼠致癇成功率的差異，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較各組大鼠海馬CA3區神經元丟失、海馬組織中SOD活力、MDA含量、Drp1蛋白、Drp1 mRNA、Cyt C、AIF及cleaved caspase-3表達的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組大鼠行為學觀察見表1。

2.2各組大鼠海馬CA3區神經元損傷的病理學觀察見圖1、表2。CON組海馬Nissl染色可見CA3區大量致密排列的錐體細胞，細胞形態完整、結構清晰，染色質分布均勻，胞質內含豐富的尼氏小體。SE后CA3區神經元脫失、排列疏松，輪廓模糊、界限不清。

2.3各組大鼠海馬組織中SOD活力、MDA含量比較見表3。

2.4各組大鼠海馬組織中Drp1蛋白和mRNA表達的變化見圖2、表4。

表1 各組大鼠致癇成功率和發作潛伏期比較

*：精確概率法。

2.5各組大鼠海馬組織中CytC、AIF及cleavedcaspase-3的表達見圖3、表5。

圖1 各組大鼠海馬CA3區神經元損傷比較(Nissl，×200)

表2 各組大鼠海馬CA3區神經元數目比較 個

F=68.693,P<0.001;*：與CON組比較，P<0.05；#：與PILO組比較，P<0.05。

*：與CON組比較，P<0.05；#：與PILO組SE 24 h亞組比較，P<0.05。

3 討論

癲癇發作中腦部神經元的高度同步化異常放電，可引起活躍的自由基反應[9-10]和線粒體動力學的改變[11-12]，打破原有的平衡狀態，引起神經元損傷。已有研究[13]證明ROS的產生與線粒體分裂關系密切，其產生隨線粒體分裂的增加而增加，可能的機制為線粒體嵴Cyt C的重新分布。該研究通過建立氯化鋰-PILO癲癇大鼠模型，證明Mdivi-1能減輕SE后氧化應激和細胞凋亡，減輕神經元損傷，具有神經保護作用。

已有研究證實線粒體損傷導致的線粒體膜通透性轉換孔開放是非酒精性脂肪肝大鼠模型肝細胞凋亡[14]和去鐵胺誘導HL-60細胞凋亡[15]的可能機制。癲癇發作也可引起線粒體功能異常[16]和動力學障礙[11-12]，線粒體受損后膜電位降低，線粒體膜通透性轉換孔開放發生通透性轉運，Cyt C及AIF釋放入胞質，通過多條凋亡信號通路介導細胞凋亡[17]，且已證明Drp1參與多個線粒體依賴的凋亡途徑[18]。Drp1的活性受翻譯后修飾及與其他物質相互作用的影響[19]。Mdivi-1是Drp1的選擇性抑制劑，抑制線粒體分裂，進而抑制線粒體外膜通透性改變和Cyt C的釋放[4]。該研究結果顯示，SE后大鼠海馬線粒體分裂增加、功能受損，導致Cyt C釋放和AIF移位至細胞核，通過激活caspase-3或直接引起染色體凝集和DNA呈大片段斷裂，導致神經元大量凋亡。Drp1選擇性抑制劑Mdivi-1可明顯緩解SE引起Cyt C釋放、AIF移位、caspase-3激活和海馬神經元凋亡；但對Drp1蛋白及mRNA表達無明顯影響，機制可能為Mdivi-1主要通過影響Drp1的分布或活性，而不是直接影響Drp1的表達，從而抑制線粒體分裂，發揮神經保護作用。

圖2 各組大鼠海馬組織中Drp1蛋白和mRNA檢測結果

A：Drp1蛋白；B：Drp1 mRNA。1：CON組；2：PILO組；3：PILO+DMSO組；4：PILO+Mdivi-1組。

表4 各組大鼠海馬組織中Drp1蛋白及mRNA表達比較

*：與CON組比較，P<0.05。

圖3 各組大鼠海馬組織中Cyt C、AIF及cleaved caspase-3的表達

A：各組線粒體內和胞質內Cyt C、線粒體內和細胞核內AIF含量；B：各組cleaved caspase-3含量。1：CON組；2：PILO組；3：PILO+DMSO組；4：PILO+Mdivi-1組。

表5 各組大鼠海馬組織中Cyt C、AIF及cleaved caspase-3含量比較

*：與CON組比較，P<0.05；#：與PILO組比較，P<0.05。

線粒體既是自由基的主要生產場所，又是氧化應激損傷的靶點。ROS和RNS可導致線粒體孔通透性轉變和Cyt C釋放，激活caspase-9和caspase-3，引起細胞凋亡[20]。該研究結果顯示SE后大鼠海馬組織內存在明顯的氧化應激損傷，且在SE后24 h最明顯；而Mdivi-1可明顯改善SE引起的MDA和SOD等氧化應激指標變化，減少神經元細胞凋亡。該研究結果提示，通過改善線粒體動力學障礙，可減輕海馬神經元的氧化應激損傷。

綜上所述，Mdivi-1對SE后海馬神經元具有神經保護的作用，為抗癲癇治療提供新的思路和方法。該研究還初步表明Mdivi-1的神經保護機制可能是降低氧化應激，抑制Cyt C釋放、AIF移位和caspase-3激活，但其具體作用機制有待進一步研究。

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(2013-12-01收稿 責任編輯趙秋民)

Effect of mitochondrial division inhibitor on hippocampal neuro in pilocarpine-induced seizures of rats

ZHANGQian1,2),ZHANGHongwei1,3),XIAJianhua1,4),LIANYajun1),XIENanchang1)

1)DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofCardiovasology(Elderly),HenanProvincialPeople′sHospital,Zhengzhou450003 3)DepartmentofNeurology,MedicalGroupGeneralHospitalofPingdingshanCoalandShenmaCompanyLtd.inChina,Pingdingshan467100 4)DepartmentofNeurology,theCentralHospitalofZhumadian,Zhumadian463000

epilepsy; mitochondrial fission; Mdivi-1; oxidative stress; apoptosis

Aim: To investigate the effect of mitochondrial division inhibitor (Mdivi-1) in pilocarpine-induced seizures and its mechanism. Methods: A total of 121 male SD rats were randomly divided into control, PILO, PILO+Mdivi-1 and PILO+DMSO group, the PILO group was further divided into four subgroups according to observation time. The behavior changes of each group were observed, while the pathological damage and levels of superoxide dismutase and malondialdehyde were detected by Nissl staining, xanthine oxidase and thiobarbituric acid method. The expression of dynamin-related protein 1, Cyt C, AIF and cleaved-caspase-3 were measured by Western blot analysis and RT-PCR. Results: Compared with PILO group (114.571±5.420), the surviving neuron number of PILO+Mdivi-1 group was increased[(157.429±6.183)；F=68.693，P<0.001]. Compared with PILO SE 24 h subgroup [(113.429±4.980)，(6.102±0.193)],the activity of SOD[(138.571±3.380)；F=21.779，P<0.001]was increased and the content of MDA(4.353±0.231)；F=27.226，P<0.001]was decreased in PILO+Mdivi-1 group. Compared with PILO group[(0.594±0.020)，(1.099±0.015)], the expression of mito-Cyt C[(0.897±0.015)；F=296.177，P<0.001]was increased and the expression of cyto-Cyt C[(0.433±0.010)；F=562.684，P<0.001]was decreased in PILO+Mdivi-1 group. Compared with PILO group[(0.878±0.037)，(1.465±0.076)], the expression of mito-AIF[(1.279±0.051)；F=59.298，P<0.001]was increased and the expression of nu-AIF[(0.896±0.044)；F=46.424，P<0.001]was decreased in PILO+Mdivi-1 group. Compared with PILO group (0.587±0.192), the expression of cleaved caspase-3[(0.463±0.022)；F=40.500，P<0.001]was decreased of PILO+Mdivi-1 group. Conclusion: Mdivi-1 has neuroprotective effect on hippocampal neuro in pilocarpine-induced seizures, and the underlying mechanism may be due to the suppression of oxidative stress and inhibition of the release of Cyt C, translocation of AIF and activation of caspase-3.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.06.003

*國家自然科學基金資助項目 81201012；81371438

R742.1