蘿卜硫素對LNCaP細胞增殖、周期、凋亡及IGFBP-3、NF-κB表達的影響

朱海鵬

鄭州大學第五附屬醫院泌尿外科 鄭州 450052

蘿卜硫素對LNCaP細胞增殖、周期、凋亡及IGFBP-3、NF-κB表達的影響

朱海鵬△

鄭州大學第五附屬醫院泌尿外科 鄭州 450052

△男，1963年11月生，本科，副主任醫師，研究方向：前列腺癌的防治，E-mail:zhuhaipeng081611@163.com

蘿卜硫素；前列腺癌；IGFBP-3；NF-κB；LNCaP細胞

目的：觀察蘿卜硫素(SFN)對人前列腺癌LNCaP細胞增殖、周期及凋亡的影響以及IGFBP-3及NF-κB在此過程中的變化。方法觀察不同濃度SFN對LNCaP細胞增殖的影響后將LNCaP細胞分為4組：對照組、SFN處理組、IGFBP-3 siRNA+SFN處理組以及IGFBP-3 siRNA處理組。MTT法分析各組細胞的增殖情況；流式細胞技術分析各組細胞的細胞周期及凋亡。實時熒光定量PCR技術和Western blot技術分析各組細胞IGFBP-3、NF-κB mRNA和蛋白表達的變化。結果隨SFN濃度的升高，LNCaP細胞存活率呈下降趨勢(F=1 391.781,P<0.001)。IGFBP-3抑制能有效減弱SFN誘導的細胞增殖抑制、G2期抑制與凋亡(F交互=271.130、121.133和95.000,P<0.05)。IGFBP-3抑制可降低SFN處理后IGFBP-3 mRNA和蛋白表達的升高，升高SFN處理后NF-κB mRNA和蛋白表達的降低(F交互=8.595和279.490,P<0.05)。結論SFN對LNCaP細胞的抑制作用可能與IGFBP-3有關，后者可能通過改變NF-κB的表達來發揮作用。

隨著人口老齡化及診斷技術的發展，我國前列腺癌的發病率逐年升高[1]。目前針對前列腺癌的藥物治療主要為激素治療，但是激素治療存在明顯的不良反應，而且在治療過程中會出現對激素敏感性的喪失，導致無效治療。蘿卜硫素(sulforaphane，SFN)是存在于十字花科植物中的一種異硫氰酸鹽。研究[2-3]證實，SFN除具有良好的抗氧化作用外，還具有顯著的抗癌作用，可以抑制乳癌、前列腺癌及直腸癌細胞的增殖，其抗癌作用是通過阻滯細胞周期以及誘導細胞凋亡實現。胰島素樣生長因子結合蛋白-3(insulin-like growth factor binding protein 3,IGFBP-3)是IGFBP家族的成員，可與胰島素樣生長因子特異性結合。研究[4]表明IGFBP-3具有一定的促凋亡作用。NF-κB是一種可誘導的、普遍存在的轉錄調控因子，它和細胞的生長、黏附、凋亡息息相關。在多種腫瘤細胞中，均存在NF-κB的過表達[5]。作者觀察了SFN對LNCaP細胞增殖、周期及凋亡的影響及IGFBP-3、NF-κB表達的變化，報道如下。

1 材料與方法

1.1材料LNCaP細胞株購自中國科學院上海生命科學研究所。RPMI 1640培養基(美國HyClone公司)，胎牛血清(杭州天杭生物科技有限公司)，EntransterTM-R RNA轉染試劑(北京英格恩公司)，siRNA序列(上海吉瑪公司)，MTT試劑、Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒(Sigma公司)，RIPA裂解液(北京普利萊生物技術公司)，小鼠抗人IGFBP-3多克隆抗體、小鼠抗人ACTB多克隆抗體及小鼠抗人多克隆NF-κB p100抗體(Abcam公司)，RNA提取試劑盒(美國QIAGEN公司)，ImProm-Ⅱ?反轉錄試劑盒、GO Taq?qPCR Master Mix [普洛麥格(北京)生物技術有限公司]，Dy-Light 800 紅外二抗(美國KPL公司)。

1.2細胞培養LNCaP細胞采用含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，放入37 ℃、含體積分數5%CO2的細胞培養箱中進行培養。選取狀態良好的對數生長期細胞進行實驗。

1.3SFN對LNCaP細胞增殖的影響制備細胞懸液，將對數生長期的LNCaP細胞以1.5×105mL-1的密度接種于96孔板，每孔150 μL。于37 ℃、含體積分數5%CO2的細胞培養箱中培養24 h后，分別加入終濃度為0、5、10、20、40 μmol/L的SFN，24 h后每孔加入15 μL MTT試劑，繼續培養4 h后，小心吸取各孔中的液體，加入100 μL DMSO，置于搖床10 min使其充分溶解。使用酶標儀測定各孔在490 nm處的吸光度。細胞存活率=實驗組吸光度/對照組吸光度×100%。每組設3個復孔，實驗重復5次。

1.4細胞分組與處理細胞分為4組：不做任何處理的細胞組(對照組)，經20 μmol/L SFN處理的細胞組(SFN組)，不經SFN處理的IGFBP-3沉默組(siRNA組)，經siRNA處理且經20 μmol/L SFN處理的細胞組(siRNA+SFN組)，以上各組處理24 h后用MTT法檢測細胞的存活率。siRNA處理方法為取對數生長期的LNCaP細胞，以1×104孔-1的密度接種于24孔板，每孔加入培養液0.45 mL，37 ℃、體積分數5%CO2培養24 h。使用無血清的RPMI 1640培養基分別稀釋siRNA與EntransterTM-R RNA轉染試劑，振蕩后室溫靜置30 min以上。吸去24孔板內原有的培養基，每孔加入上述混合液50 μL。加入含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基0.45 mL,混均繼續培養48 h后，使用PCR和Western blot技術驗證IGFBP-3在mRNA水平與蛋白水平的沉默效果。每組設3個復孔，實驗重復5次。

1.5各組LNCaP細胞細胞周期檢測取對數生長期的LNCaP細胞，按1.4中分組處理后繼續培養24 h后，收集細胞，使用冰PBS洗滌細胞，用體積分數70%冷乙醇4 ℃固定過夜。PBS洗滌細胞，加入50 mg/L PI 500 μL，4 ℃避光靜置30 min。上流式細胞儀分析細胞周期。每組設3個復孔，實驗重復5次。

1.6各組LNCaP細胞凋亡檢測取對數生長期的LNCaP細胞，按1.4中分組處理后繼續培養24 h后，收集細胞，使用冰PBS洗滌細胞，離心后使用Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒中提供的含10 mmol/L HEPES/NaOH、140 mmol/L NaCl以及2.5 mmol/L CaCl2的緩沖液500 μL重懸細胞。依次加入5 μL Annexin V以及10 μL PI，常溫避光靜置10 min后，使用流式細胞儀分析細胞凋亡率。每組設3個復孔，實驗重復5次。

1.7各組LNCaP細胞IGFBP-3與NF-κBmRNA及蛋白表達水平測定取對數生長期的LNCaP細胞，按1.4中分組處理后繼續培養24 h。使用RNA提取試劑盒提取各組細胞的RNA，反轉錄為cDNA。使用GO Taq?qPCR Master Mix試劑盒對合成的cDNA進行PCR擴增。IGFBP-3(263 bp)上游引物：5’-CAGCCAGCGCGCTACAAGTTGACTA-3’,下游引物：5’-CTGGGACTCAGCACATTGAGGA-3’；NF-κB(482 bp)上游引物：5’-CAAGCGAGGAGGGGACGTG-3’,下游引物：5’-CCCCCAGAGCCTCCACCC-3’；β-actin(186 bp)上游引物： 5’-TGGCACCCAGCACAAT GAA-3’, 下游引物：5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAG AAGCA-3’。反應體系和擴增條件參考試劑盒內說明書。使用2-ΔΔCT法分析各樣本IGFBP-3的相對表達情況。實驗重復5次。

各組細胞分組處理后，使用RIPA蛋白裂解液(500 μL/孔)提取蛋白樣本。將蛋白樣本與緩沖液混勻，煮沸5 min后上樣，每孔上樣量保證為30 μg。電泳后電轉至PVDF膜。50 g/L脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h。分別使用小鼠抗人IGFBP-3抗體(按1:500稀釋)、小鼠抗人NF-κB抗體(按1:100稀釋)與小鼠抗人β-actin抗體(按1:1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，使用PBST洗滌未結合的一抗。使用Dy-Light 800紅外標記的二抗避光孵育膜2 h，使用PBST洗滌除去多余二抗，利用奧德賽遠紅外成像系統分析蛋白條帶。實驗重復5次。

1.8統計學處理使用SPSS 18.0處理數據。采用單因素方差分析比較不同濃度的SFN對LNCaP細胞存活力的影響，采用析因設計的方差分析比較SFN和IGFBP-3 siRNA轉染對LNCaP細胞增殖、細胞周期、凋亡及IGFBP-3及NF-κB 表達水平的影響。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1不同濃度的SFN對LNCaP細胞增殖的影響及各組LNCaP細胞存活率比較0、5、10、20、40 μmol/L的SFN處理24 h后，LNCaP細胞存活率為100%、(85.35±12.68)%、(75.68±18.36)%、(55.63±15.60)%以及(45.66±13.80)% (F=1 391.781,P<0.001)。各組LNCaP細胞存活率見表1。

表1 各組細胞存活率比較(n=5) %

FSFN=1 791.130,P<0.001；FIGFBP-3 siRNA轉染=83.130，P<0.001；F交互=271.130，P<0.001。

2.2各組LNCaP細胞細胞周期比較未經任何處理的對照組，G1期細胞占(70.58±8.25)%，G2期細胞占(5.61±1.23)%，SFN組G2期細胞百分比增至(31.11±9.68)%，G1期細胞下降到(48.66±11.23)%，提示SFN造成了LNCaP細胞的G2期阻滯。IGFBP-3的沉默緩解了SFN引起的G2期阻滯。見表2。

表2 各組細胞G2期比例比較(n=5) %

FSFN=2 148.050,P<0.001；FIGFBP-3 siRNA轉染=120.849，P<0.001；F交互=121.133，P<0.001。

2.3各組LNCaP細胞凋亡率比較見表3。

表3 各組細胞凋亡率比較(n=5) %

FSFN=561.695,P<0.001；FIGFBP-3 siRNA轉染=95.000，P<0.001；F交互=95.000，P<0.001。

2.4各組LNCaP細胞IGFBP-3及NF-κB表達水平比較見表4、5和圖1。Western blot分析發現，SFN處理后，IGFBP-3蛋白的表達水平有所提高，NF-κB的表達水平有所下降，而經過siRNA處理后，細胞內的IGFBP-3的表達水平高于對照組，但是低于單純的SFN處理組。同時,與單純SFN處理相比，siRNA處理后細胞NF-κB的表達水平下降程度較輕。

表4 各組細胞IGFBP-3 mRNA水平比較(n=5)

FSFN=2 778.307,P<0.001；FIGFBP-3 siRNA轉染=1 424.220，P<0.001；F交互=8.595，P=0.010。

表5 各組細胞NF-κB mRNA水平比較(n=5)

FSFN=3 717.579,P<0.001；FIGFBP-3 siRNA轉染=11.236，P=0.004；F交互=279.490，P<0.001。

圖1 各組細胞IGFBP-3與NF-κB蛋白的表達

3 討論

SFN可以通過調節不同的靶分子實現阻滯細胞周期以及誘導細胞凋亡的作用。這能解釋該研究中使用SFN處理LNCaP細胞后，出現了細胞增殖抑制、周期阻滯、凋亡率增高等現象。既往研究[6-7]認為SFN誘導的細胞凋亡實際也是依賴于對細胞周期的控制，但這種對細胞周期的控制并不依賴P53這個經典的周期調控分子。該研究結果顯示，對于不經SFN處理的LNCaP細胞，IGFBP-3沉默并不影響細胞增殖、周期和凋亡。但是對于SFN處理的細胞，IGFBP-3抑制可拮抗SFN對LNCaP細胞的增殖抑制、G2周期阻滯和誘導細胞凋亡作用，提示SFN可能通過IGFBP-3發揮抗前列腺癌細胞增殖的作用。

IGFBP-3調控細胞增殖的作用已經得到了證實。其機制包括依賴IGF-1途徑以及非依賴IGF-1途徑。一方面IGFBP-3可以與IGF-1特異性結合，從而使與IGF-1受體結合的IGF-1減少，細胞生長受限，這是一條經典的理論。另一方面，有研究[8]指出，IGFBP-3可與細胞周期調節蛋白作用從而影響細胞周期。此外，IGFBP-3還可與一些凋亡調控因子如MAPK通路的蛋白、Caspase家族、Bax、Bad等作用發揮促凋亡作用[9]。當然也有證據[10]顯示，IGFBP-3還可以抑制很多受NF-κB活性調控的因子，如炎性因子等。有研究[11]發現IGFBP-3可通過一種新發現的IGFBP-3受體影響Caspase-3的活性，進而負向調節NF-κB通路。該研究結果顯示IGFBP-3抑制可下調SFN處理后IGFBP-3 mRNA和蛋白表達的升高，上調SFN處理后NF-κB mRNA和蛋白表達的降低。

綜上所述，SFN能夠抑制LNCaP細胞的增殖，其機制涉及IGFBP-3表達水平的變化，SFN可能通過IGFBP-3影響NF-κB通路從而發揮作用。

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(2014-03-20收稿 責任編輯徐春燕)

Effects of sulforaphane on proliferation, cell cycle and apoptosis of LNCaP and expressions of IGFBP-3 and NF-κB

ZHUHaipeng

DepartmentofUrology,theFifthAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

sulforaphane; prostate cancer; IGFBP-3; NF-κB; LNCaP cell

Aim: To investigate the effects of sulforaphane on proliferation, cell cycle and apoptosis of LNCaP and expressions of IGFBP-3 and NF-κB. Methods: The effects of SFN at different concentrations on LNCaP cells were observed. LNCaP cells were divided into four groups, including control group, 20 μmol/L SFN treated group, IGFBP-3 siRNA+20 μmol/L SFN treated group and IGFBP-3 siRNA treated group. MTT assay was used to evaluate the cell proliferation.Cell cycle arrest and the cell apoptosis were detected by flow cytometry.Further more, the expressions of IGFBP-3 and NF-κB in mRNA level and protein level were analyzed by real-time quantitative PCR and Western blot respectively.Results: SFN could inhibit the proliferation of LNCaP cells in a dose-dependent manner(F=1 391.781,P<0.001). The inhibition of IGFBP-3 could antagonize the proliferation inhibition, G2phase arrest and apoptosis induced by SFN(Finteraction=271.130,121.133 and 95.000,P<0.05).The inhibition of LNCap could depress the increased expression of IGFBP-3 mRNA and protein after SFN treatment,while increase the reduced expressions of NF-κB mRNA and protein by SFN treatment(Finteraction=8.595，279.490,P<0.05).Conclusion: SNF can inhibit the LNCaP cells′ proliferation and the mechanism may associate with the changes of IGFBP-3, which may play a role in this process by changing the level of NF-κB.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.06.009

R737.25