Galectin-1在大腸癌細胞系中的表達及意義

呂志強，朱曦齡，郭曉東，馬立芝

(武警總醫院急救醫學中心，北京100039)

·基礎研究·

Galectin-1在大腸癌細胞系中的表達及意義

呂志強，朱曦齡，郭曉東，馬立芝

(武警總醫院急救醫學中心，北京100039)

目的 探討Galectin-1在大腸癌細胞系中的表達情況，以及與大腸癌侵襲、轉移的關系。方法用Real time-RT PCR法和免疫組織化學法分析Galectin-1mRNA及蛋白在5種大腸癌細胞系的表達情況;用Boyden小室法比較5種大腸癌細胞系的侵襲轉移能力。結果 Galectin-1在大腸癌轉移灶來源的細胞系中的表達高于大腸癌原發灶來源的細胞系(P＜0.01);Boyden小室的結果顯示大腸癌轉移灶來源的細胞系的侵襲，轉移能力高于大腸癌原發灶來源的細胞系。結論 Galectin-1的高表達可能與大腸癌的侵襲轉移有一定關系。

結直腸腫瘤;凝集素類;腫瘤轉移;腫瘤侵潤

大腸癌為消化道常見惡性腫瘤。近年來，大腸癌在我國發病率及死亡率均呈上升趨勢。其中腫瘤早期轉移是死亡的關鍵原因，所以研究與大腸癌侵襲、轉移的相關因素，探索新的抗腫瘤途徑對于臨床治療具有重要的意義。

Galectins屬于凝集素家族，是人體內大量存在的一大類糖結合蛋白。它參與細胞的增殖、分化、凋亡及免疫調節等多種生物功能［1］。Galectin-1是該家族中第一個被發現的成員，研究表明，它與腫瘤的轉移、浸潤、生長和粘附有關［2］，目前已進入臨床試驗研究［3］。在本研究中，我們觀察Galectin-1在不同轉移能力的大腸癌細胞系的表達，分析其在腫瘤發生、轉移中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞 人大腸癌細胞株 LoVo、SW620、SW480、HT29、LS174T購自中國醫學科學院腫瘤研究所。SW620與LoVo來源于大腸癌患者的淋巴結轉移灶，具有較高的侵襲轉移能力;SW480，HT29和LS174T都來源于大腸癌的原發病灶，侵襲轉移能力相對較低。

1.2 主要試劑 RPMI1640培養基(Gibco公司)，TRIzol購自Invitrogen公司，SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒購自TaKaRa公司，Reverse Transcription System試劑盒購自Promega公司，侵襲小室(Boyden小室)購自Chemicon公司，鼠抗人Galectin-1單克隆抗體、免疫組織化學染色試劑盒SP-9000購自武漢博士德公司。

1.3 細胞培養 細胞株 LoVo、SW620、SW480、HT29、LS174T至于37℃、5%CO2培養箱內培養，培養基采用含10%胎牛血清的RPMI1640。

1.4 Real-time PCR檢測細胞系中Galectin-1 mRNA的表達

1.4.1 RNA的制備 待細胞生長狀態良好、鋪滿瓶壁后，提取細胞總RNA，參照TRIzol試劑說明書。

1.4.2 cDNA第1鏈的合成 按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應，反應總體系為20 μl。42℃反應1 h，95℃滅活逆轉錄酶5 min。

1.4.3 熒光定量PCR(Real-time RT－PCR) 基因β-actin作為內參，同時檢測Galectin-1和β-actin的表達，計算出樣本中Galectin-1mRNA的相對表達量，以Folds=2－ΔΔCt表示實驗組與對照組目的基因表達的倍比關系［4］，ΔΔCt=［Ct(target gene)－Ct (β-actin)］實驗組－［Ct(target gene)－Ct(β－actin)］對照組。重復3次，計算平均值。在本實驗中實驗組為SW620，LoVo，HT29、LS174T;對照組為SW480。采用Primer 5.0設計引物。應用Mx3000P定量 PCR儀(Stratagene)進行實驗，反應條件為94℃ 30 s，55℃30 s，72℃30 s，45個循環，熒光信號檢測。

1.5 免疫組織化學方法檢測Galectin-1在大腸癌細胞系中的表達 免疫組織化學方法按照說明書常規操作。以鼠抗人Galectin-1單克隆抗體(1∶200)為一抗，以羊抗鼠為二抗(即用型抗體)，用蘇木素進行復染細胞核。出現棕黃色為陽性，按照顏色深淺，分為弱陽性(+)、陽性(++)與強陽性(++ +)。

1.6 細胞體外侵襲實驗 應用Boyden小室法［5］，該小室是利用Engelbreth Holm-Swarm(EHS)小鼠腫瘤組織成分重新構建的人工基底膜ECMatrixTM，小室孔徑為8.0 μm。

實驗前將Boyden小室從冰箱中取出，置于培養箱中，使之溫度調節到37℃。在內室中加300 μl無血清的RPMI-1640培養液，置于培養箱中孵育1～2 h，使ECMatrix層親水。細胞用胰酶消化制成單細胞懸液，無血清的RPMI1640洗3遍后，細胞計數，上室接種腫瘤細胞300 μl(含1×105個細胞);用500 μl含10%胎牛血清的完全培養基作為趨化因子置于下室。37℃、5%CO2濕化培養箱內孵育48 h，取出小室，用棉簽擦去上室內未穿過濾膜的細胞，取出濾膜，中性甲醛固定，蘇木素染色。在200倍光鏡下隨機取5個視野計數，取其均值代表浸潤力量值。

1.7 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件包進行處理，Real-time RT－PCR的結果采用析因設計的方差分析，體外侵襲實驗的結果采用完全隨機設計的方差分析，兩兩之間的比較采用LSD法。

2 結果

2.1 Galectin-1 mRNA在細胞中的表達 細胞總mRNA經逆轉錄成cDNA后，進行熒光定量PCR檢測，在溶解曲線上未見到雜峰，說明沒有非特異性擴增，擴增產物單一。從擴增曲線可見所有樣品均已進入平臺期，說明反應條件準確。產物通過瓊脂糖電泳鑒定，5個不同的樣品擴增得到的產物單一，符合引物設計時的擴增長度(195bp)。通過對各樣本Ct值進行計算分析，以SW480為對照組，其余各細胞系為實驗組，結果發現 SW620，LoVo，LS174T，HT29中 Galectin-1 mRNA的表達水平分別是SW480的13.7，6.8，1.21，0.47倍，差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 Galectin-1的免疫組織化學檢測結果 Galectin-1在SW620中表達呈強陽性，在SW480中表達呈弱陽性。

2.3 5種細胞系體外侵襲實驗 48 h后可以看到腫瘤細胞降解濾膜上的人工基底膜膠，并穿過微孔，結果顯示各細胞系的浸潤能力為SW620(132.6± 13.4)，LoVo(118.9±17.2)高于SW480(96.2±10.3)，LS174T(70.2±5.9)，HT29(52.1±7.8)(P＜0.05)。

3 討論

Galectin-1屬于凝集素家族，國內外許多研究已經證實，其在黑色素瘤［6］、胰腺癌［7］、前列腺癌、甲狀腺腫瘤、結腸癌、膀胱癌及卵巢癌等多種腫瘤中的表達增高，并與其發生及轉移相關［8-9］。近年來，研究證實了Galectin-1能通過調節肌動蛋白細胞骨架，促進腫瘤血管生成，促進腫瘤細胞的侵襲、遷移［10-11］。

在本研究中，SW480，HT29和LS174T都來源于大腸癌的原發病灶，SW620和LoVo來源于大腸癌患者的淋巴結轉移灶，通過熒光定量PCR檢測，發現Galectin-1 mRNA在大腸癌轉移灶來源的細胞系(SW620，LoVo)中的表達高于原發灶來源的細胞系(SW480，HT29，LS174T)。通過免疫組織化學，發現Galectin-1蛋白在轉移灶來源的大腸癌細胞系SW620中表達為強陽性，而在原發病灶來源的細胞中表達呈弱陽性。某一特定的腫瘤組織中，并不是所有的細胞都具有相同的轉移能力，只有一部分細胞具有較高的轉移能力，可以形成轉移灶。也就是說來源于轉移灶的腫瘤細胞，可能具有某些使其運動能力增強，促進其轉移的物質。通過Boyden小室實驗，我們證實了來源于轉移灶細胞系的侵襲轉移能力在體外高于原發灶來源的細胞系。由此，認為Galectin-1的高表達與細胞的侵襲轉移能力有一定的相關性。

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The expression of Galectin-1in human colorectal carcinoma cells and its significance

LV Zhi-qiang，ZHU Xi-ling，GUO Xiao-dong，MA Li-zhi(Emergency Center，General Hospital of Armed Police Forces，Beijing 100039，China) Corresponding author:GUO Xiao-dong，E-mail:Guoxiaodong59122@sina.com

Objective To explore the expression of Galectin-1 gene in colorectal cancer cell lines and its correlation with tumor metastasis.Methods Expression of Galectin-1 in colorectal cancer cell lines was detected by Real time－RT PCR and imunohistochemistry.In vitro invasiveness was determined by Boyden chamber assay.The correlation of Galectin-1 expression with the invasive ability was also analyzed.Results Galectin-1 was highly ex-pressed in LoVo and SW620.In vitro，cell invasivion demonstrated that LoVo and SW620 had a higher invasive ability than LS174T，SW480 or HT29.Conclusion Galectin-1 may play an important role in invasion and metastasis of colorectal cancer.

Colorectal neoplasms;Agglutinins;Neoplasm metastasis;Neoplasm invasiveness

R735.34

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2012.04.022

2012-01-09)

呂志強，主治醫師，E-mail:wjjzklzq@163.com

郭曉東，副主任醫師，E-mail:Guoxiaodong59122@sina.com