腎炎寧對IgA腎病大鼠腎臟轉(zhuǎn)化生長因子Smad2信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的影響

梁建英 陳欣華 蘇白玉 寇立巧 高艷 郭登洲

·論著·

腎炎寧對IgA腎病大鼠腎臟轉(zhuǎn)化生長因子Smad2信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的影響

梁建英 陳欣華 蘇白玉 寇立巧 高艷 郭登洲

目的觀察腎炎寧對IgA腎病(IgAN)大鼠腎臟病理學(xué)改變的影響，以探討該方劑針對IgAN的治療效果以及作用和機制。方法將30只健康雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按重量(g)隨機分為3個組，每組分為10只，分別分為正常組、模型組和腎炎寧組。除正常組外其余2組均給予隔日1次口服0.1%牛血清白蛋白(BSA)酸化水共6周，在第7周開始后每周連續(xù)給3 d尾靜脈注射BSA緩沖溶液，共連續(xù)給6周，并于第8周末追加注射葡萄球菌腸毒素B(SEB)，每周只給1次，共給連續(xù)3周后以復(fù)制IgAN實驗?zāi)Ｐ停＝M大鼠口服及注射均等量0.9%氯化鈉注射液。于第9周末開始對腎炎寧組給予腎炎寧煎劑灌胃服用，正常組組、模型組均灌服等量0.9%氯化鈉注射液，總共給藥8周。并分別于造模型前、造模型后第6個周末、8個周末、12個周末、第16個周末用代謝籠收集24 h的尿液，并進行24 h的尿蛋白定量測定。于16周末處死實驗大鼠，股動脈取血樣，留取實驗大鼠腎臟組織，在光鏡觀察大鼠腎小球的變化，免疫熒光觀察IgA沉積情況，免疫組化及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對腎組織中Smad2進行半定量分析。結(jié)果與正常組比較，模型組和腎炎寧組陽性增強的核占小球細胞的百分比值顯示顯著增加(P<0.05)，與模型組比較，腎炎寧組的表達情況明顯低下(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果可以顯示：與正常組相比較，模型組和腎炎寧組Smad2mRNA的值顯著增加(P<0.05)，與模型組比較，腎炎寧表達情況明顯降低(P<0.05)。結(jié)論腎炎寧能夠抑制受體活化性蛋白smad2的表達，從而抑制IgAN大鼠腎臟中smad2信號傳導(dǎo)通路的激活，減少大鼠腎臟ECM沉積，延緩IgAN的進程。

IgA腎病；腎炎寧；動物實驗；腎臟轉(zhuǎn)化生長因；smad2信號傳導(dǎo)系統(tǒng)

IgA腎病又稱Berger病，是指腎小球系膜區(qū)以IgA或IgA沉積為主的一種原發(fā)性腎小球腎炎，臨床上典型表現(xiàn)有血尿，伴有或不伴有蛋白尿，是我國較為常見的腎小球疾病之一，也是終末期腎衰的主要原因之一[1，2]。嚴重危害人們的身體健康，目前認為IgA腎病是導(dǎo)致腎纖維化的主要因素。多數(shù)學(xué)者認為多種細胞因子[如白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等]參與了本病的發(fā)病過程，它們直接或間接導(dǎo)致腎小球系膜外基質(zhì)的沉積，加速了腎小球的硬化。本研究通過腎炎寧對大鼠腎組織腎臟病理學(xué)改變的影響，探討其對腎臟的保護機制為有效的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取健康的雄性大鼠共30只，清潔等級，重量(130±10)g，實驗所用動物由河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供飼養(yǎng)環(huán)境30只大鼠置于安靜的空調(diào)房內(nèi)飼養(yǎng)，室溫保持在18～23℃，相對濕度保持在45%～55%，分裝到6只飼養(yǎng)籠中，每日更換墊料，開窗通風(fēng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)實驗動物1周以后用代謝籠留取大鼠的尿液，并用試紙條來檢測尿蛋白、尿潛血均為陰性者入組，并根據(jù)大鼠的體重(g)給予排序，隨機分為3個組：正常組、模型組、腎炎寧組，每組10只。

1.2 實驗藥物和受試藥物 中藥(黃芪、生地黃、仙鶴草、黨參、白術(shù)、白茅根、茯苓、墨旱蓮、川芎、女貞子、三七粉、甘草)，均由河北省中醫(yī)院中藥房提供，實驗藥物用水煎濃縮至含生藥3.9 g/ml，放置于瓶中密封4℃存放以備應(yīng)用，18.7 g·kg-1·d-1灌胃。

1.3 主要實驗試劑與實驗儀器 牛血清白蛋白SBA是由美國Sigma公司提供的。葡萄球菌腸毒素SEB是由中國軍事科學(xué)研究院微生物流行病研究所給予提供。DEPC是由美國Amresco公司給予提供。Trizol是由北京索萊寶生物科技有限公司給予提供。異丙醇是由天津市博迪化工有限公司提供。瓊脂糖由上海GENE生物有限公司提供。勻漿器(JJ-1型定時電動攪拌器 )是由國華儀器廠給予提供。Sartorius是由電子天平北京賽多利斯天平有限公司給予提供。水平電泳槽、DYY-12型電腦三恒多用電泳儀均由北京市六一儀器廠提供。醫(yī)學(xué)圖像定量分析系統(tǒng)由武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司提供等

1.4 模型制備 新鮮的雙蒸水中加入鹽酸,濃度為8.5 mmol/L。即1 000 ml雙蒸水中加入10%鹽酸3.2 ml。1% BSA酸化水的制備,1 g BSA加入1 000 ml酸化水。4℃保存以備使用。1% BSA緩沖溶液的制備是將1 g BSA溶于100 ml的0.9%氯化鈉注射液中。必須是現(xiàn)用現(xiàn)配。造模方法是依據(jù)文獻的方法[1],除正常對照組小鼠自由飲食水外，其余2組均在其基礎(chǔ)上隔日口服含0.1% BSA的酸化水6周,6周后按10 mg/kg每日1次定期尾靜脈注射1%BSA緩沖液,每周連續(xù)3 d，于第8周按0.4 mg/kg,每周1次,連續(xù)3周,復(fù)加尾靜脈注射SEB。正常組口服及注射同等量0.9%氯化鈉溶液，于16周末處死動物。

1.5 給藥方法 于造模第9周開始給藥，1次/d，腎炎寧組給予中藥煎劑18.7 g/kg、d灌胃，正常組和模型組給予相當(dāng)劑量的0.9%氯化鈉注射液灌胃，3組總共給藥8周。

1.6 觀察指標(biāo)及方法 分別于造模型前及造模型后的第6個周末，第8個周末，第12個周末，第16個周末將大鼠放置于代謝籠當(dāng)中，一定要禁食，但讓其自由飲水。造模后第16周末處死大鼠，股動脈取血，分離血清，全部大鼠給藥第8周末處死大鼠，分離出腎臟，0.9%氯化鈉溶液沖洗，留取需要的組織塊。

2 結(jié)果

2.1 3組一般情況 正常組大鼠飲食正常，其余兩組在口服BAS緩沖液期間飲食、外觀都與正常組大鼠無差別。尾靜脈注射BAS后，2組大鼠出現(xiàn)倦怠，嗜睡，食欲減退等癥狀，3 d后上述癥狀好轉(zhuǎn)。尾靜脈注射SEB后，模型組大鼠精神萎靡，少動抱團，1周以后癥狀改善。

2.2 大鼠腎臟組織Smad2蛋白以及其基因方面表達的影響 免疫組化染色分析顯示：與正常實驗組相比較，模型實驗組和腎炎寧實驗組陽性增強的核占小球細胞的百分比值顯著增加(P<0.05)，與模型實驗組相比較，腎炎寧實驗組的表達明顯有所降低(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果分析顯示：與正常實驗組相比較，模型實驗組和腎炎寧實驗組Smad2mRNA顯著增加(P<0.05)，與模型實驗組相比較，腎炎寧實驗組的表達數(shù)值明顯降低(P<0.05)。見表1，圖1。

3 討論

IgA腎病是一組臨床很常見的腎小球疾病，其發(fā)病機制尚未完全闡明，其中免疫病理學(xué)顯示在腎小球的系膜區(qū)有IgA或以IgA為主的顆粒樣物質(zhì)沉積,臨床表現(xiàn)以血尿為主，伴或不伴有蛋白尿，是導(dǎo)致慢性腎功能衰竭的一個很重要的原因[3]。

西醫(yī)認為IgA的發(fā)病機制很復(fù)雜。發(fā)病機制尚不明確，大多數(shù)學(xué)者認為因本病屬于免疫復(fù)合物介導(dǎo)的腎小球腎炎，因此免疫反應(yīng)在本病的發(fā)病中起主要作用[4-6]。IgA分子有IgA1和IgA2兩種亞型，其中沉積于IgA腎病腎小球系膜區(qū)的為多聚IgA1(PIgA)。IgA1分子包含一個高度糖基化的鉸鏈區(qū)，這個鉸鏈區(qū)是由一段18個氨基酸殘基組成的肽鏈。它具有高度糖基化，在對IgA分子構(gòu)型的研究上發(fā)現(xiàn),IgA1分子至少含有6個O-型糖基位點。因此認為,IgAN患者血清中IgA1鉸鏈區(qū)糖基化發(fā)生了改變致使IgA1的O-糖鏈末端半乳糖缺失是造成腎系膜沉積的重要原因，IgA1鏈區(qū)核心1-β,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的活性下降而致O-糖鏈末端半乳糖缺乏丟失,從而暴露出次末端的GalNac,并對暴露出糖基上新的抗原決定簇[4]，使機體識別后新產(chǎn)生的抗原決定簇病形成與之具有特異性的抗體，二者相結(jié)合產(chǎn)生抗原抗體復(fù)合物，最終沉積在腎臟的系膜區(qū)。這種異常糖基化的IgA1失去了與肝細胞膜上特異性受體結(jié)合的能力,不能被肝細胞識別和清除，聚合成PIgA沉積在腎小球系膜區(qū)[7-11]。

表1 3組Smad2水平比較

組別Smad2正常組11.29±2.07模型組47.21±5.57*腎炎寧組30.88±6.13*#

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

正常組 模型組 腎炎寧組

細胞因子在本病的進展中起到一定的作用，例如白介素(IL-1、IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TGF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)等都通過各種途徑參與并刺激腎小球系膜上細胞的增殖。并導(dǎo)致細胞外基質(zhì)在腎小球和腎小管中大量堆積，使腎小球發(fā)生硬化、腎間質(zhì)纖維化形成，以致于最終導(dǎo)致腎功能衰竭[8]。

歷代醫(yī)家在其著作里都曾對本病的發(fā)病原因進行闡述：《素問·氣厥論》謂:“胞移熱于膀胱,則癃溺血”，提出了本病的病因為膀胱有熱；《金匱要略》指出:“熱在下焦者則尿血”，首次提出了“尿血”的病名；《痿論》中指出:“悲哀太甚則胞絡(luò)絕也,胞絡(luò)絕則陰氣內(nèi)動也,發(fā)則心下崩,數(shù)溲血也”。《諸病源候論》中也有學(xué)者認為:“勞損于腎,動傷經(jīng)絡(luò),又為風(fēng)冷所侵,血氣擊搏,故腰痛是也”。血尿多與熱有關(guān)，血尿的病機與熱、虛、瘀、外感風(fēng)熱之邪侵襲人體有關(guān)；思慮勞倦過度，損傷脾胃，致使氣血失和，濕熱內(nèi)聚，熱傷血絡(luò)，熱迫血妄行，則發(fā)病；腎陰虧則虛也，陰虛則內(nèi)熱也，灼傷血絡(luò)而導(dǎo)致尿血，而出血又多伴有瘀滯，瘀血阻滯經(jīng)絡(luò)，則血不循經(jīng)，故血尿不止；此外邪熱下擾腎絡(luò)，則往往使血尿加重或反復(fù)[12，13]。張永鵬等[6]通過對IgA腎病中醫(yī)辨證規(guī)律的研究,發(fā)現(xiàn)本病的病機多呈從陰虛到氣陰兩虛再到陰陽兩虛的過程，而且常因外感、濕熱、勞累、飲食不當(dāng)?shù)日T因而誘發(fā),使病情進一步加重。

以“益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)”為大法的腎炎寧能改善IgA大鼠的一般情況，能夠抑制受體活化性蛋白smad2的表達，從而抑制IgA大鼠腎臟中smad2信號傳導(dǎo)通路的激活，減少大鼠腎臟ECM沉積，延緩IgA的進程，進而緩解腎臟損傷。

1 Tarelli E,Smith AC,Hendry BM,et al.Human serum IgA1 is substituted with up to six O-glycans as shown by matrix assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry.Carbohydr Res,2004,339:2329-2335.

2 Tarelli E,Smith AC,Hendry BM,et al.Human serum IgA1 is substituted with up to six O-glycans as shown by matrix assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry.Carbohydr Res,2004,339:2329-2335.

3 謝院生,陳香美.扁桃體與IgA腎病的發(fā)病和治療.中華腎臟病雜志,2004,20: 300-302.

4 史勝平,周武斌.黃芪治療小鼠巨細胞病毒性肝炎的實驗研究.中國現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué)雜志，2007，6：7-8.

5 Zhang M，Chiu LC，Cheung PC,et al.Growth-inhibitory effects of a heta-glucan from themycelium ofPoria cocos on human breast carcinomaMCF-7 cells: cell-cycle arrest and apoptosis induction.Oncol Rep，2006，15: 637-643.

6 張永鵬,申寶娜,劉宏偉.中醫(yī)藥治療IgA腎病探析.河南中醫(yī),2000,20:28-29

7 余凌,李驚子,王海燕.黃芪當(dāng)歸在腎臟疾病中的應(yīng)用及其機制研究進展.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2001,21:396.

8 于江月,李樹青.黃芪對自發(fā)性高血壓大鼠早期腎組織NO和NOS的影響.心臟雜志,2007,19:406-420.

9 林可意,曾龍驛.轉(zhuǎn)化生長因子-β在糖尿病腎病發(fā)生中的作用.國際內(nèi)科學(xué)雜志,2007,34:379

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11 焦坤,陳佩東.白茅根研究概括.江蘇中醫(yī)藥,2008,40: 91-93.

12 楊立鵬.腎炎寧治療非腎病綜合征IgA腎病的檔分析.中外醫(yī)學(xué)研究，2012，10：16-17.

13 郭登洲，邊東，王月華，等.腎炎寧治療非腎病綜合征IgA腎病的療效觀察.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，29：841-844.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.15.007

050011 河北省石家莊市第一醫(yī)院干部科(梁建英)，心內(nèi)科(陳欣華)，內(nèi)分泌科(蘇白玉)；河北省石家莊市第二醫(yī)院病案科(寇立巧)；唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院(高艷)；河北省中醫(yī)院(郭登洲)

R 692.6

A

1002-7386(2014)15-2261-03

2014-01-22)