巴西橡膠樹β—木糖苷酶基因的克隆與生物信息學(xué)分析

古小玲++涂敏

摘 要 以巴西橡膠樹根為材料，利用RT-PCR技術(shù)從總RNA中捕獲到一個(gè)β-木糖苷酶家族基因（β-xylosidase 或β-D-xyloside xylohydrolase，EC 3.2.1.37），cDNA長(zhǎng)度2 880 bp，開放閱讀框2 319 bp，編碼773個(gè)氨基酸，命名為HbEC32。在HbEC32氨基酸序列中具有一個(gè)較強(qiáng)的跨膜區(qū)，二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明其屬于混合型蛋白。HbEC32在N端前8～20氨基酸區(qū)域內(nèi)為較強(qiáng)的疏水區(qū)，但整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性。對(duì)15個(gè)β-木糖苷酶蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，巴西橡膠樹的HbEC32基因與蓖麻親緣關(guān)系最近。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹 ；HbEC32 ；基因克隆 ；序列分析

分類號(hào) S794.1

橡膠產(chǎn)業(yè)面臨著多種病蟲害的危害，橡膠樹根病是其中的一類重要土傳性病害[1]。此類病害主要是由擔(dān)子菌和子囊菌中不同種的真菌危害巴西根系而造成，首先影響橡膠樹的生長(zhǎng)，引起葉片發(fā)黃、樹枝缺水干枯，降低膠乳產(chǎn)量，最后直接導(dǎo)致整株樹死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。目前研究表明，在植物與病原菌互作中，病原菌形成一系列入侵、快速生長(zhǎng)、迅速擴(kuò)散的機(jī)制；而植物細(xì)胞形成了含有大量的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的細(xì)胞壁，形成了堅(jiān)固的壁壘[4]。其中，木聚糖酶是其入侵寄主植物的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，植物木聚糖酶主要包括外切β-1，4-木聚糖酶、內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶和β-木糖苷酶[5]。筆者在橡膠樹根中克隆到橡膠樹β-木糖苷酶相關(guān)基因，為橡膠樹木聚糖酶。深入對(duì)橡膠樹β-木糖苷酶基因進(jìn)行研究，了解橡膠樹β-木糖苷酶在受根病病原菌侵染時(shí)的表達(dá)水平，是否存在表達(dá)相關(guān)的抑制性蛋白，對(duì)研究橡膠樹根病防治和抗根病具有重要意義。本研究以巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）嫩根為材料，通過比較分析多種植物的β-木糖苷酶基因的保守序列，設(shè)計(jì)特異引物，采用RT-PCR的方法獲得了HbEC32完整開放閱讀框序列，從而為橡膠樹根病致病機(jī)理研究和橡膠樹抗根病分子育種奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

樹根：巴西橡膠樹熱研7-33-97品系的組培苗的幼嫩根，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所國(guó)家種質(zhì)資源圃提供。

試劑：高保真Taq酶、T4 DNA連接酶、RNA酶抑制劑、pMD19-T載體（大連寶生物公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司），感受態(tài)細(xì)胞菌種為Escherichia coli JM109（北京全式金生物技術(shù)有限公司），DNA凝膠和PCR產(chǎn)物回收試劑盒（Axygen公司）。

引物合成與測(cè)序送深圳華大完成。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA第一鏈的合成

采用改良的CTAB法[3]提取巴西橡膠樹熱研7-33-97品系組培苗嫩根的總RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，取1 μg總RNA進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，具體操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.2.2 HbEC32的克隆與序列測(cè)定

從NCBI網(wǎng)站獲取已發(fā)表的人參、番茄、蓖麻、葡萄等作物[6-9]的β-木糖苷酶基因序列，通過生物信息學(xué)分析軟件，進(jìn)行同源性比對(duì)，利用保守區(qū)域的序列設(shè)計(jì)引物，正向引物5′-GTTTGTTAGCTCTTTACTCTCTATCAAC-3′反向引物5′-TGGGAGTATGAAAAAAA TAATAATAAT-3′，采用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行基因克隆，獲取基因開放閱讀框完整序列。以1.2.1獲得的cDNA第一鏈為模板50 ng，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃變性5 min，94℃變性30 S，58℃退火30 S，72℃延伸2.5 min，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸15 min。利用1.0%瓊脂糖凝膠，電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在紫外燈下回收目的條帶；利用DNA凝膠和PCR產(chǎn)物回收試劑盒進(jìn)行純化回收，回收的目的片段克隆到載體pMD19-T，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中，篩選陽性菌株送測(cè)序。

1.2.3 HbEC32基因生物信息學(xué)分析

對(duì)以獲得的基因序列進(jìn)行相關(guān)的生物信息學(xué)分析。通過DNAMAN軟件對(duì)目的基因開放閱讀框的預(yù)測(cè)、以及蛋白的基本性質(zhì)進(jìn)行分析；利用NCBI序列比對(duì)分析目的基因的氨基酸保守結(jié)構(gòu)域；利用Predict Protein、TMpred和ServerProtScale在線蛋白質(zhì)分析軟件分析HbEC32蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜方向、蛋白質(zhì)跨膜區(qū)、疏水性和親水性；利用Clustal X 1.83軟件對(duì)15個(gè)不同來源的β-木糖苷酶相關(guān)基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA與反轉(zhuǎn)錄cDNA的檢測(cè)

電泳結(jié)果表明，通過改良的CTAB法提取的橡膠樹幼嫩根RNA完整性很好（圖1）。由圖1可以看出，28 S條帶比18 S條帶亮2倍，無拖尾；A260/A280比值在1.80～2.0，提取的RNA純度達(dá)到反轉(zhuǎn)錄cDNA要求；反轉(zhuǎn)錄cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物在1 100 bp左右，條帶清晰、亮度適中（圖2），提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA質(zhì)量較好，可用于后續(xù)的基因擴(kuò)增。

2.2 HbEC32的RT-PCR擴(kuò)增

1.0%瓊脂糖凝膠上電泳結(jié)果顯示，4個(gè)重復(fù)泳道，都出現(xiàn)清晰的唯一條帶，對(duì)比Marker，大小在3 000 bp左右的地方（圖3），PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與引物設(shè)計(jì)的目的片段的分子量大小相一致，可以用于下一步回收、連接、轉(zhuǎn)化送測(cè)序。

2.3 HbEC32的序列分析

DNAMAN軟件對(duì)目的基因測(cè)序分析表明，獲得的HbEC32基因長(zhǎng)度2 880 bp，開放閱讀框2 319 bp，編碼氨基酸773個(gè)（圖4），分子量約為85.15 ku，理論等電點(diǎn)為7.90。通過NCBI比對(duì)結(jié)果來知，目標(biāo)蛋白與糖基水解酶家族和木糖糖苷酶有很高的同源性（圖5）。HbEC32蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果中，α螺旋（H）占25.90%，β折疊（E）占15.80%，無規(guī)則卷曲（L）占58.30%，預(yù)測(cè)HbEC32蛋白屬于混合型蛋白（圖6）。endprint

2.4 HbEC32蛋白的親水性/疏水性分析

巴西橡膠樹HbEC32蛋白的疏水性/親水性在線預(yù)測(cè)結(jié)果表明：HbEC32蛋白多肽鏈在第15位表現(xiàn)出最強(qiáng)的疏水性，分值為2.78；在第710位表現(xiàn)出最強(qiáng)的親水性，分值為-2.94；N端前8～20氨基酸范圍內(nèi)有一較強(qiáng)的疏水區(qū)；總體來說，此多肽鏈表現(xiàn)出較強(qiáng)的親水性（圖7）。

2.5 HbEC32蛋白跨膜區(qū)分析

TMpred進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)和跨膜方向的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，HbEC32蛋白氨基酸序列中3～24和524～544處出現(xiàn)分值1367和561的跨膜結(jié)構(gòu)域，屬可溶性型、可跨膜蛋白類（圖8），這一結(jié)果與ProtScale預(yù)測(cè)的HbEC32蛋白多肽鏈表現(xiàn)為親水性一致。

2.6 HbEC32基因的進(jìn)化分析

利用Clustal X 1.83軟件對(duì)HbEC32基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示：15個(gè)β-木糖苷酶基因可分為2大類，可可的β-木糖苷酶基因家族4號(hào)基因與其它的進(jìn)化距離較大，其他物種和橡膠樹HbEC32歸為一類，其中蓖麻和橡膠樹進(jìn)化距離最近（圖9）。

說明：15個(gè)β-木糖苷酶基因：橡膠樹（Hb）、蓖麻（Rc）、毛楊（Pt）、可可（Tc1、Tc2、Tc3、Tc4）、甜橙（Cs）、野草莓（Fv）、葡萄（Vv）、擬南芥（At3、At7）、馬鈴薯（St）、碧桃（Pp）、鷹嘴豆（Ca）。

3 討論與結(jié)論

在植物與病原菌互作中，分泌細(xì)胞壁降解酶是病原菌的一種入侵機(jī)制[10]。而寄主植物為防御病原菌的侵入，一方面主動(dòng)識(shí)別病原菌木聚糖酶，使木聚糖酶作為激發(fā)子引發(fā)宿主的一系列防衛(wèi)反應(yīng)[11]，另一方面，寄主植物通過合成木聚糖酶抑制蛋白來抑制病原菌木聚糖酶的活性，產(chǎn)生防御效果[12]。寄主植物的抑制蛋白會(huì)根據(jù)病原菌的木聚糖酶的不同而形成一系列結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式、作用特異性等特征各異的家族成員，而且這種變化常常是由很少數(shù)的幾個(gè)氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)決定的[13]。

目前，橡膠樹的木聚糖酶家族基因的研究還比較少，而橡膠樹中真菌病害卻比較多。本研究從橡膠樹根中分離得到的β-木糖苷酶基因是木聚糖酶龐大家族的一員，推測(cè)對(duì)于橡膠樹根病病原菌來說，木聚糖酶可能是其入侵寄主植物的物質(zhì)基礎(chǔ)，與橡膠樹的細(xì)胞壁合成和病原菌防御有著密切的關(guān)系。但確定其是否能夠影響橡膠樹的抗病性，還需后續(xù)進(jìn)一步進(jìn)行功能和表達(dá)分析的研究。本研究獲得的橡膠樹β-木糖苷酶基因?qū)橄鹉z樹根病防治和抗根病研究奠定一定的分子理論基礎(chǔ)。

致 謝 感謝中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所國(guó)家天然橡膠種質(zhì)資源圃提供巴西橡膠樹品系熱研7-33-97的樹根材料。

參考文獻(xiàn)

[1] 黃宗道. 熱帶北緣橡膠樹栽培[M]. 廣州：廣東科技出版社，1987.

[2] 黃貴修，許燦光. 中國(guó)天然橡膠病蟲草害識(shí)別與防治[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2012.

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[8] Ronen R， Zauberman G， Akerman M， et al. Xylanase and xylosidase activities in avocado fruit[J]. Plant Physiol，1991，95（3）：961-964.

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[11] 王 瑾. 茶樹葉部由病原真菌侵染引發(fā)的內(nèi)源糖苷酶及咖啡堿合成相關(guān)酶基因差異表達(dá)[D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[12] 周 潔，鄭祥梓，蘭 斕，等. 稻瘟病菌假定的糖基水解酶62家族初步研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（8）：2 754-2 762.

[13] Claudia A，Bustamante，Pedro M Civello，et al. Cloning of the promoter region of β-xylosidase （FaXyl1） gene and effect of plant growth regulators on the expression of FaXyl1in strawberry fruit[J]. Plant Science， 2009， 177： 49-56.endprint

2.4 HbEC32蛋白的親水性/疏水性分析

巴西橡膠樹HbEC32蛋白的疏水性/親水性在線預(yù)測(cè)結(jié)果表明：HbEC32蛋白多肽鏈在第15位表現(xiàn)出最強(qiáng)的疏水性，分值為2.78；在第710位表現(xiàn)出最強(qiáng)的親水性，分值為-2.94；N端前8～20氨基酸范圍內(nèi)有一較強(qiáng)的疏水區(qū)；總體來說，此多肽鏈表現(xiàn)出較強(qiáng)的親水性（圖7）。

2.5 HbEC32蛋白跨膜區(qū)分析

TMpred進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)和跨膜方向的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，HbEC32蛋白氨基酸序列中3～24和524～544處出現(xiàn)分值1367和561的跨膜結(jié)構(gòu)域，屬可溶性型、可跨膜蛋白類（圖8），這一結(jié)果與ProtScale預(yù)測(cè)的HbEC32蛋白多肽鏈表現(xiàn)為親水性一致。

2.6 HbEC32基因的進(jìn)化分析

利用Clustal X 1.83軟件對(duì)HbEC32基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示：15個(gè)β-木糖苷酶基因可分為2大類，可可的β-木糖苷酶基因家族4號(hào)基因與其它的進(jìn)化距離較大，其他物種和橡膠樹HbEC32歸為一類，其中蓖麻和橡膠樹進(jìn)化距離最近（圖9）。

說明：15個(gè)β-木糖苷酶基因：橡膠樹（Hb）、蓖麻（Rc）、毛楊（Pt）、可可（Tc1、Tc2、Tc3、Tc4）、甜橙（Cs）、野草莓（Fv）、葡萄（Vv）、擬南芥（At3、At7）、馬鈴薯（St）、碧桃（Pp）、鷹嘴豆（Ca）。

3 討論與結(jié)論

在植物與病原菌互作中，分泌細(xì)胞壁降解酶是病原菌的一種入侵機(jī)制[10]。而寄主植物為防御病原菌的侵入，一方面主動(dòng)識(shí)別病原菌木聚糖酶，使木聚糖酶作為激發(fā)子引發(fā)宿主的一系列防衛(wèi)反應(yīng)[11]，另一方面，寄主植物通過合成木聚糖酶抑制蛋白來抑制病原菌木聚糖酶的活性，產(chǎn)生防御效果[12]。寄主植物的抑制蛋白會(huì)根據(jù)病原菌的木聚糖酶的不同而形成一系列結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式、作用特異性等特征各異的家族成員，而且這種變化常常是由很少數(shù)的幾個(gè)氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)決定的[13]。

目前，橡膠樹的木聚糖酶家族基因的研究還比較少，而橡膠樹中真菌病害卻比較多。本研究從橡膠樹根中分離得到的β-木糖苷酶基因是木聚糖酶龐大家族的一員，推測(cè)對(duì)于橡膠樹根病病原菌來說，木聚糖酶可能是其入侵寄主植物的物質(zhì)基礎(chǔ)，與橡膠樹的細(xì)胞壁合成和病原菌防御有著密切的關(guān)系。但確定其是否能夠影響橡膠樹的抗病性，還需后續(xù)進(jìn)一步進(jìn)行功能和表達(dá)分析的研究。本研究獲得的橡膠樹β-木糖苷酶基因?qū)橄鹉z樹根病防治和抗根病研究奠定一定的分子理論基礎(chǔ)。

致 謝 感謝中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所國(guó)家天然橡膠種質(zhì)資源圃提供巴西橡膠樹品系熱研7-33-97的樹根材料。

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[11] 王 瑾. 茶樹葉部由病原真菌侵染引發(fā)的內(nèi)源糖苷酶及咖啡堿合成相關(guān)酶基因差異表達(dá)[D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

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[13] Claudia A，Bustamante，Pedro M Civello，et al. Cloning of the promoter region of β-xylosidase （FaXyl1） gene and effect of plant growth regulators on the expression of FaXyl1in strawberry fruit[J]. Plant Science， 2009， 177： 49-56.endprint

2.4 HbEC32蛋白的親水性/疏水性分析

巴西橡膠樹HbEC32蛋白的疏水性/親水性在線預(yù)測(cè)結(jié)果表明：HbEC32蛋白多肽鏈在第15位表現(xiàn)出最強(qiáng)的疏水性，分值為2.78；在第710位表現(xiàn)出最強(qiáng)的親水性，分值為-2.94；N端前8～20氨基酸范圍內(nèi)有一較強(qiáng)的疏水區(qū)；總體來說，此多肽鏈表現(xiàn)出較強(qiáng)的親水性（圖7）。

2.5 HbEC32蛋白跨膜區(qū)分析

TMpred進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)和跨膜方向的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，HbEC32蛋白氨基酸序列中3～24和524～544處出現(xiàn)分值1367和561的跨膜結(jié)構(gòu)域，屬可溶性型、可跨膜蛋白類（圖8），這一結(jié)果與ProtScale預(yù)測(cè)的HbEC32蛋白多肽鏈表現(xiàn)為親水性一致。

2.6 HbEC32基因的進(jìn)化分析

利用Clustal X 1.83軟件對(duì)HbEC32基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示：15個(gè)β-木糖苷酶基因可分為2大類，可可的β-木糖苷酶基因家族4號(hào)基因與其它的進(jìn)化距離較大，其他物種和橡膠樹HbEC32歸為一類，其中蓖麻和橡膠樹進(jìn)化距離最近（圖9）。

說明：15個(gè)β-木糖苷酶基因：橡膠樹（Hb）、蓖麻（Rc）、毛楊（Pt）、可可（Tc1、Tc2、Tc3、Tc4）、甜橙（Cs）、野草莓（Fv）、葡萄（Vv）、擬南芥（At3、At7）、馬鈴薯（St）、碧桃（Pp）、鷹嘴豆（Ca）。

3 討論與結(jié)論

在植物與病原菌互作中，分泌細(xì)胞壁降解酶是病原菌的一種入侵機(jī)制[10]。而寄主植物為防御病原菌的侵入，一方面主動(dòng)識(shí)別病原菌木聚糖酶，使木聚糖酶作為激發(fā)子引發(fā)宿主的一系列防衛(wèi)反應(yīng)[11]，另一方面，寄主植物通過合成木聚糖酶抑制蛋白來抑制病原菌木聚糖酶的活性，產(chǎn)生防御效果[12]。寄主植物的抑制蛋白會(huì)根據(jù)病原菌的木聚糖酶的不同而形成一系列結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式、作用特異性等特征各異的家族成員，而且這種變化常常是由很少數(shù)的幾個(gè)氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)決定的[13]。

目前，橡膠樹的木聚糖酶家族基因的研究還比較少，而橡膠樹中真菌病害卻比較多。本研究從橡膠樹根中分離得到的β-木糖苷酶基因是木聚糖酶龐大家族的一員，推測(cè)對(duì)于橡膠樹根病病原菌來說，木聚糖酶可能是其入侵寄主植物的物質(zhì)基礎(chǔ)，與橡膠樹的細(xì)胞壁合成和病原菌防御有著密切的關(guān)系。但確定其是否能夠影響橡膠樹的抗病性，還需后續(xù)進(jìn)一步進(jìn)行功能和表達(dá)分析的研究。本研究獲得的橡膠樹β-木糖苷酶基因?qū)橄鹉z樹根病防治和抗根病研究奠定一定的分子理論基礎(chǔ)。

致 謝 感謝中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所國(guó)家天然橡膠種質(zhì)資源圃提供巴西橡膠樹品系熱研7-33-97的樹根材料。

參考文獻(xiàn)

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