一株來自紅樹林土壤的利普斯他汀產生菌的分離鑒定與發酵特性初步研究

趙培靜++繆承杜++梁淑娃++夏楓耿

摘 要 從紅樹林土壤中篩選到一株產利普斯他汀（Lipstatin）的菌株GWL1.2012，通過形態特征、生理生化及16S rDNA序列分析，對該菌進行鑒定。結果顯示，菌株GWL1.2012與毒三素鏈霉菌形成一個類群，同源性高達99.7%，故將其鑒定為毒三素鏈霉菌（Streptomyces toxytricini），并對菌株GWL1.2012發酵特性進行初步研究，為以后的產業化開發生產提供參考依據。

關鍵詞 紅樹林 ；鏈霉菌 ；鑒定 ；利普斯他汀 ；發酵

分類號 Q939.1

肥胖是全球成年人最大的慢性疾病，被世界衛生組織（WHO）明確認定為導致疾病發生的十大危險因素之一。治療和遏制肥胖已成為全球醫學攻關的重要內容。主要有食欲抑制劑、產熱劑、消化吸收阻滯劑、激素調控劑等四大類數十種藥物。微生物發酵產生的利普司他汀（Lipstatin）能選擇性抑制胃腸道中胰脂肪酶的活性，減少脂肪的分解和吸收。其四氫衍生物奧利司他（Orlistat）被成功開發為新型減肥藥物[1]，是目前作為非中樞神經系統作用的唯一一個治療肥胖癥的藥物[2]。研究表明，奧利司他非全身作用、具有良好耐受性和有效性，不用食欲抑制劑而治療肥胖，為肥胖癥的藥物治療開辟了新途徑[3]。

本研究對廣東湛江紅樹林土壤進行選擇性分離，并從中篩選分離到新型減肥藥物奧利司他前體物質尼泊司他汀產生菌菌株，對活性菌株進行了分類鑒定及發酵的初步研究，旨在發掘具有潛在應用前景的新型減肥活性藥物菌株，為進一步開發利用海洋來源的新型藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣

2013年秋季，通過多點取樣法從廣東湛江紅樹林淤泥土中采集土樣。

1.1.2 培養基

固體培養基：高氏培養基、燕麥片瓊脂培養基[4]。

發酵培養基：甘油（1.5%），胰蛋白胨（2.0%），豆油（4%），燕麥粉（0.8%），ZnSO4（0.01%）， CaCO3（0.5%），復合乳化劑（0.05%），裝量80 mL/500 mL錐形燒瓶，將菌株接種到發酵培養基中，30℃，200 r/min，培養7 d，觀察其發酵情況，檢測發酵產物。

1.2 菌株的分離及鑒定

1.2.1 菌株分離

對采集到的紅樹林淤泥進行選擇性微生物分離，采用以豆油為唯一碳源的改良燕麥瓊脂培養基進行菌株分離[5-6]。涂布于含不同濃度豆油的分離平板上，培養觀察生長狀況，代謝產物經色譜分析確認，獲得放線菌菌株GWL1.2012，菌株保藏于廣東省微生物種質資源庫。

1.2.2 形態觀察

將分離得到的菌株分別接種到固體平板上插片培養，30℃培養7～10 d，每24 h觀察菌落形態，并進行革蘭氏染色觀察細胞形態。

1.2.3 生理生化特征觀察

參照《伯杰氏系統細菌學手冊》（第九版）[7]和《鏈霉菌鑒定手冊》[8]進行生理生化特征的測定觀察。

1.2.4 16S rRNA 基因擴增、測序與構建系統發育樹

以實驗室已有16S rRNA 基因通用引物，對分離菌株進行菌落PCR擴增 16S rDNA，正向引物，27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物，1492R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。擴增總體積50 μL，94℃預變性30min，94℃變性1 min，60℃ 退火0.5 min， 72℃延伸1.5 min，進行30個循環，72℃延伸10 min。用上海生工DNA純化回收試劑盒對PCR產物進行回收，與 pMD18-T 載體連接，送由上海英駿生物技術有限公司完成測序。從Genbank數據庫中獲取與分離菌株親源關系較近的模式菌株核糖體基因16S（16S rRNA基因）區域序列，結合在GenBank中經BLAST 獲取到的菌株16SrRNA基因，運用MEGA4.1軟件模型，采用鄰接法（NJ） 構建系統發育樹（Replications=1000，Bootstrap值取百分比）。

1.3 搖瓶發酵

1.3.1 發酵培養

將菌株GWL1.2012接種到發酵培養基中，接種量10%，30℃，220 r/min，培養192 h，每12 h取樣檢測，每批3個重復，取其平均值，繪制pH變化和濕重變化曲線。

1.3.2 尼泊司他汀活性測定

菌株發酵粗提物制備 參考Janos[9]方法，菌株192 h后結束發酵培養。取發酵液高速冷凍離心（10 000 r/min，18℃，10 min） ，取菌體，將菌體于細胞破碎儀破碎，離心后取上清，作為提取粗體樣品，備用。

產物測定通過HPLC方法與標準品進行標定分析[10]。

2 結果與分析

通過對采集到的紅樹林淤泥進行選擇性微生物分離，獲得高產利普斯他汀的放線菌菌株GWL1.201，進一步對該菌株進行分類鑒定和發酵初步研究。

2.1 形態特征

菌株GWL1.2012在固體平板上培養10 d的菌落形態特征：菌落粉狀，肉粉色至粉灰色，產生大量孢子，褐色可溶色素，見圖1。顯微特征為基內菌絲無色，氣生菌絲分叉較多，松散螺旋狀、柔曲，產孢，孢子橢圓形，表面光滑，見圖2。

根據《伯杰氏系統細菌學手冊》比對分析，發現該菌株GWL1.2012在固體平板上的生長狀態、顯微形態特征，與鏈霉菌屬菌株相似，可將其歸屬為鏈霉菌。

2.1.2 生理生化特征

進一步對菌株GWL1.2012進行部分生理生化鑒定，結果見表1。

根據《鏈霉菌鑒定手冊》進行生理生化的檢endprint

測與比對分析，發現該菌株GWL1.2012的生化特征與毒三素鏈霉菌特征相一致，可初步鑒定為毒三素鏈霉菌（Streptomyces toxytricini）。

2.1.3 系統發育樹的構建與分析

菌株GWL1.2012的核糖體基因中的16S區域經測序，長度為1 437 bp，通過BLAST與GenBank數據庫相關序列比對，構建系統發育樹，見圖3。結果顯示該序列與Streptomyces toxytricini相似性最高，為99.7%。根據放線菌16SrDNA序列在分類鑒定中的劃分依據，大于99%即可歸為同一個種，可將其鑒定為毒三素鏈霉菌。

結合GWL1.2012的生長形態、生理生化特征及16SrDNA序列分析結果，菌株GWL1.2012鑒定為毒三素鏈霉菌。

2.2 搖瓶發酵初步研究

菌株GWL1.2012菌體濕重隨培養時間逐漸增加，0～48 h為生長遲緩期，48 h后開始增長加快，進入生長對數期， 60～144 h菌種生長進入穩定期，隨著培養時間的延長繁殖速度漸減，死亡數逐漸增加進入衰亡期；從發酵開始速效碳源被快速利用pH稍有降低，24 h起開始利用遲效碳源pH逐漸上升，60～144 h菌體生長階段維持在6.7～6.9，之后隨菌體也溶解衰亡pH一直升高到7.3以上，結合菌體濕重生長狀態基本一致，見圖4。

2.3 發酵產物尼泊司他汀測定

同時通過對其發酵過程的檢測數據分析發現，發酵60 h左右時，產物Lipstatin開始生成，隨著菌株進入穩定生長期而逐漸增加，到發酵結束時濃度達到最大值為1 900 mg/L，見圖5。

3 結論與討論

本研究對采集到的紅樹林淤泥進行選擇性微生物分離，獲得高產利普斯他汀的放線菌菌株GWL1.2012，也是國內首次報道由紅樹林淤泥分離得到產lipstatin的菌株；通過培養生長形態特征、生理生化特性研究以及16S rDNA 的基因序列分析比對，GWL1.2012鑒定為毒三素鏈霉菌；對菌株的發酵代謝過程及產物進行了初步研究，發酵水平達到1 900 mg/L，領先國內已有文獻報道水平；微生物來源的酶抑制劑是一類重要的微生物次級代謝產物，也成為了新型減肥藥物開發的重要途徑。菌株GWL1.2012能產生活性較強的脂肪酶抑制代謝產物利普斯他汀，將進一步對其進行發酵優化及代謝產物深入研究， 有望開發為新型的減肥藥物。

參考文獻

[1] MELIA A T， Zh I J， ZE I R， et al. The interact ion of the liposeinhibitor orlistat with ethanol in healthy volunteers[J]. Eur J Clin Pharmacol， 1998， 54（9-10）： 773-775.

[2] Hollander P A， Elbein S C， Hirsch I B， et al. Role of orlistat in the treatment of obese patients with type 2 diabetes[J] . DIABET ES CARE， 1998， 21（8）： 1 288-1 289.

[3] 馬 微，付 麗，等.新型減肥藥奧利司他的研究進展[J]. 華西藥學雜志，2009，24（4）：431-433.

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[7] John G H， Bergey D H， Noel R K. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology（9th Revised edition[M].

[8] Group of Actinomycetes Taxonomy of Institute of Microbiology of Chinese Academy of Sciences.Streptomyces identification manual（ in Chinese）[M].Beijing：Science Press（北京：科學出版社）， 1975.

[9] Janos E， Eva G， Gabor B， et al. Fermentation process for lipstatin and method of extracting lipstatin from a fermentation broth： US， 6844174[P]. 2005-01-18.

[10] 胡為民，莊英萍，王永紅，等. 毒三素鏈霉菌生產利普司他汀的發酵與提取工藝[J]. 中國醫藥工業雜志，2007，38（10）：705-708.endprint

測與比對分析，發現該菌株GWL1.2012的生化特征與毒三素鏈霉菌特征相一致，可初步鑒定為毒三素鏈霉菌（Streptomyces toxytricini）。

2.1.3 系統發育樹的構建與分析

菌株GWL1.2012的核糖體基因中的16S區域經測序，長度為1 437 bp，通過BLAST與GenBank數據庫相關序列比對，構建系統發育樹，見圖3。結果顯示該序列與Streptomyces toxytricini相似性最高，為99.7%。根據放線菌16SrDNA序列在分類鑒定中的劃分依據，大于99%即可歸為同一個種，可將其鑒定為毒三素鏈霉菌。

結合GWL1.2012的生長形態、生理生化特征及16SrDNA序列分析結果，菌株GWL1.2012鑒定為毒三素鏈霉菌。

2.2 搖瓶發酵初步研究

菌株GWL1.2012菌體濕重隨培養時間逐漸增加，0～48 h為生長遲緩期，48 h后開始增長加快，進入生長對數期， 60～144 h菌種生長進入穩定期，隨著培養時間的延長繁殖速度漸減，死亡數逐漸增加進入衰亡期；從發酵開始速效碳源被快速利用pH稍有降低，24 h起開始利用遲效碳源pH逐漸上升，60～144 h菌體生長階段維持在6.7～6.9，之后隨菌體也溶解衰亡pH一直升高到7.3以上，結合菌體濕重生長狀態基本一致，見圖4。

2.3 發酵產物尼泊司他汀測定

同時通過對其發酵過程的檢測數據分析發現，發酵60 h左右時，產物Lipstatin開始生成，隨著菌株進入穩定生長期而逐漸增加，到發酵結束時濃度達到最大值為1 900 mg/L，見圖5。

3 結論與討論

本研究對采集到的紅樹林淤泥進行選擇性微生物分離，獲得高產利普斯他汀的放線菌菌株GWL1.2012，也是國內首次報道由紅樹林淤泥分離得到產lipstatin的菌株；通過培養生長形態特征、生理生化特性研究以及16S rDNA 的基因序列分析比對，GWL1.2012鑒定為毒三素鏈霉菌；對菌株的發酵代謝過程及產物進行了初步研究，發酵水平達到1 900 mg/L，領先國內已有文獻報道水平；微生物來源的酶抑制劑是一類重要的微生物次級代謝產物，也成為了新型減肥藥物開發的重要途徑。菌株GWL1.2012能產生活性較強的脂肪酶抑制代謝產物利普斯他汀，將進一步對其進行發酵優化及代謝產物深入研究， 有望開發為新型的減肥藥物。

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測與比對分析，發現該菌株GWL1.2012的生化特征與毒三素鏈霉菌特征相一致，可初步鑒定為毒三素鏈霉菌（Streptomyces toxytricini）。

2.1.3 系統發育樹的構建與分析

菌株GWL1.2012的核糖體基因中的16S區域經測序，長度為1 437 bp，通過BLAST與GenBank數據庫相關序列比對，構建系統發育樹，見圖3。結果顯示該序列與Streptomyces toxytricini相似性最高，為99.7%。根據放線菌16SrDNA序列在分類鑒定中的劃分依據，大于99%即可歸為同一個種，可將其鑒定為毒三素鏈霉菌。

結合GWL1.2012的生長形態、生理生化特征及16SrDNA序列分析結果，菌株GWL1.2012鑒定為毒三素鏈霉菌。

2.2 搖瓶發酵初步研究

菌株GWL1.2012菌體濕重隨培養時間逐漸增加，0～48 h為生長遲緩期，48 h后開始增長加快，進入生長對數期， 60～144 h菌種生長進入穩定期，隨著培養時間的延長繁殖速度漸減，死亡數逐漸增加進入衰亡期；從發酵開始速效碳源被快速利用pH稍有降低，24 h起開始利用遲效碳源pH逐漸上升，60～144 h菌體生長階段維持在6.7～6.9，之后隨菌體也溶解衰亡pH一直升高到7.3以上，結合菌體濕重生長狀態基本一致，見圖4。

2.3 發酵產物尼泊司他汀測定

同時通過對其發酵過程的檢測數據分析發現，發酵60 h左右時，產物Lipstatin開始生成，隨著菌株進入穩定生長期而逐漸增加，到發酵結束時濃度達到最大值為1 900 mg/L，見圖5。

3 結論與討論

本研究對采集到的紅樹林淤泥進行選擇性微生物分離，獲得高產利普斯他汀的放線菌菌株GWL1.2012，也是國內首次報道由紅樹林淤泥分離得到產lipstatin的菌株；通過培養生長形態特征、生理生化特性研究以及16S rDNA 的基因序列分析比對，GWL1.2012鑒定為毒三素鏈霉菌；對菌株的發酵代謝過程及產物進行了初步研究，發酵水平達到1 900 mg/L，領先國內已有文獻報道水平；微生物來源的酶抑制劑是一類重要的微生物次級代謝產物，也成為了新型減肥藥物開發的重要途徑。菌株GWL1.2012能產生活性較強的脂肪酶抑制代謝產物利普斯他汀，將進一步對其進行發酵優化及代謝產物深入研究， 有望開發為新型的減肥藥物。

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