一株來(lái)自紅樹林土壤的利普斯他汀產(chǎn)生菌的分離鑒定與發(fā)酵特性初步研究

趙培靜++繆承杜++梁淑娃++夏楓耿

摘 要 從紅樹林土壤中篩選到一株產(chǎn)利普斯他汀（Lipstatin）的菌株GWL1.2012，通過(guò)形態(tài)特征、生理生化及16S rDNA序列分析，對(duì)該菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，菌株GWL1.2012與毒三素鏈霉菌形成一個(gè)類群，同源性高達(dá)99.7%，故將其鑒定為毒三素鏈霉菌（Streptomyces toxytricini），并對(duì)菌株GWL1.2012發(fā)酵特性進(jìn)行初步研究，為以后的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 紅樹林 ；鏈霉菌 ；鑒定 ；利普斯他汀 ；發(fā)酵

分類號(hào) Q939.1

肥胖是全球成年人最大的慢性疾病，被世界衛(wèi)生組織（WHO）明確認(rèn)定為導(dǎo)致疾病發(fā)生的十大危險(xiǎn)因素之一。治療和遏制肥胖已成為全球醫(yī)學(xué)攻關(guān)的重要內(nèi)容。主要有食欲抑制劑、產(chǎn)熱劑、消化吸收阻滯劑、激素調(diào)控劑等四大類數(shù)十種藥物。微生物發(fā)酵產(chǎn)生的利普司他汀（Lipstatin）能選擇性抑制胃腸道中胰脂肪酶的活性，減少脂肪的分解和吸收。其四氫衍生物奧利司他（Orlistat）被成功開發(fā)為新型減肥藥物[1]，是目前作為非中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用的唯一一個(gè)治療肥胖癥的藥物[2]。研究表明，奧利司他非全身作用、具有良好耐受性和有效性，不用食欲抑制劑而治療肥胖，為肥胖癥的藥物治療開辟了新途徑[3]。

本研究對(duì)廣東湛江紅樹林土壤進(jìn)行選擇性分離，并從中篩選分離到新型減肥藥物奧利司他前體物質(zhì)尼泊司他汀產(chǎn)生菌菌株，對(duì)活性菌株進(jìn)行了分類鑒定及發(fā)酵的初步研究，旨在發(fā)掘具有潛在應(yīng)用前景的新型減肥活性藥物菌株，為進(jìn)一步開發(fā)利用海洋來(lái)源的新型藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣

2013年秋季，通過(guò)多點(diǎn)取樣法從廣東湛江紅樹林淤泥土中采集土樣。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：高氏培養(yǎng)基、燕麥片瓊脂培養(yǎng)基[4]。

發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油（1.5%），胰蛋白胨（2.0%），豆油（4%），燕麥粉（0.8%），ZnSO4（0.01%）， CaCO3（0.5%），復(fù)合乳化劑（0.05%），裝量80 mL/500 mL錐形燒瓶，將菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min，培養(yǎng)7 d，觀察其發(fā)酵情況，檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物。

1.2 菌株的分離及鑒定

1.2.1 菌株分離

對(duì)采集到的紅樹林淤泥進(jìn)行選擇性微生物分離，采用以豆油為唯一碳源的改良燕麥瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行菌株分離[5-6]。涂布于含不同濃度豆油的分離平板上，培養(yǎng)觀察生長(zhǎng)狀況，代謝產(chǎn)物經(jīng)色譜分析確認(rèn)，獲得放線菌菌株GWL1.2012，菌株保藏于廣東省微生物種質(zhì)資源庫(kù)。

1.2.2 形態(tài)觀察

將分離得到的菌株分別接種到固體平板上插片培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)7～10 d，每24 h觀察菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 生理生化特征觀察

參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》（第九版）[7]和《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》[8]進(jìn)行生理生化特征的測(cè)定觀察。

1.2.4 16S rRNA 基因擴(kuò)增、測(cè)序與構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

以實(shí)驗(yàn)室已有16S rRNA 基因通用引物，對(duì)分離菌株進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增 16S rDNA，正向引物，27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物，1492R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。擴(kuò)增總體積50 μL，94℃預(yù)變性30min，94℃變性1 min，60℃ 退火0.5 min， 72℃延伸1.5 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。用上海生工DNA純化回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，與 pMD18-T 載體連接，送由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序。從Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取與分離菌株親源關(guān)系較近的模式菌株核糖體基因16S（16S rRNA基因）區(qū)域序列，結(jié)合在GenBank中經(jīng)BLAST 獲取到的菌株16SrRNA基因，運(yùn)用MEGA4.1軟件模型，采用鄰接法（NJ） 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Replications=1000，Bootstrap值取百分比）。

1.3 搖瓶發(fā)酵

1.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)

將菌株GWL1.2012接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量10%，30℃，220 r/min，培養(yǎng)192 h，每12 h取樣檢測(cè)，每批3個(gè)重復(fù)，取其平均值，繪制pH變化和濕重變化曲線。

1.3.2 尼泊司他汀活性測(cè)定

菌株發(fā)酵粗提物制備 參考Janos[9]方法，菌株192 h后結(jié)束發(fā)酵培養(yǎng)。取發(fā)酵液高速冷凍離心（10 000 r/min，18℃，10 min） ，取菌體，將菌體于細(xì)胞破碎儀破碎，離心后取上清，作為提取粗體樣品，備用。

產(chǎn)物測(cè)定通過(guò)HPLC方法與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)定分析[10]。

2 結(jié)果與分析

通過(guò)對(duì)采集到的紅樹林淤泥進(jìn)行選擇性微生物分離，獲得高產(chǎn)利普斯他汀的放線菌菌株GWL1.201，進(jìn)一步對(duì)該菌株進(jìn)行分類鑒定和發(fā)酵初步研究。

2.1 形態(tài)特征

菌株GWL1.2012在固體平板上培養(yǎng)10 d的菌落形態(tài)特征：菌落粉狀，肉粉色至粉灰色，產(chǎn)生大量孢子，褐色可溶色素，見圖1。顯微特征為基內(nèi)菌絲無(wú)色，氣生菌絲分叉較多，松散螺旋狀、柔曲，產(chǎn)孢，孢子橢圓形，表面光滑，見圖2。

根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該菌株GWL1.2012在固體平板上的生長(zhǎng)狀態(tài)、顯微形態(tài)特征，與鏈霉菌屬菌株相似，可將其歸屬為鏈霉菌。

2.1.2 生理生化特征

進(jìn)一步對(duì)菌株GWL1.2012進(jìn)行部分生理生化鑒定，結(jié)果見表1。

根據(jù)《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行生理生化的檢endprint

測(cè)與比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該菌株GWL1.2012的生化特征與毒三素鏈霉菌特征相一致，可初步鑒定為毒三素鏈霉菌（Streptomyces toxytricini）。

2.1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建與分析

菌株GWL1.2012的核糖體基因中的16S區(qū)域經(jīng)測(cè)序，長(zhǎng)度為1 437 bp，通過(guò)BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。結(jié)果顯示該序列與Streptomyces toxytricini相似性最高，為99.7%。根據(jù)放線菌16SrDNA序列在分類鑒定中的劃分依據(jù)，大于99%即可歸為同一個(gè)種，可將其鑒定為毒三素鏈霉菌。

結(jié)合GWL1.2012的生長(zhǎng)形態(tài)、生理生化特征及16SrDNA序列分析結(jié)果，菌株GWL1.2012鑒定為毒三素鏈霉菌。

2.2 搖瓶發(fā)酵初步研究

菌株GWL1.2012菌體濕重隨培養(yǎng)時(shí)間逐漸增加，0～48 h為生長(zhǎng)遲緩期，48 h后開始增長(zhǎng)加快，進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期， 60～144 h菌種生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)繁殖速度漸減，死亡數(shù)逐漸增加進(jìn)入衰亡期；從發(fā)酵開始速效碳源被快速利用pH稍有降低，24 h起開始利用遲效碳源pH逐漸上升，60～144 h菌體生長(zhǎng)階段維持在6.7～6.9，之后隨菌體也溶解衰亡pH一直升高到7.3以上，結(jié)合菌體濕重生長(zhǎng)狀態(tài)基本一致，見圖4。

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物尼泊司他汀測(cè)定

同時(shí)通過(guò)對(duì)其發(fā)酵過(guò)程的檢測(cè)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵60 h左右時(shí)，產(chǎn)物L(fēng)ipstatin開始生成，隨著菌株進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期而逐漸增加，到發(fā)酵結(jié)束時(shí)濃度達(dá)到最大值為1 900 mg/L，見圖5。

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)采集到的紅樹林淤泥進(jìn)行選擇性微生物分離，獲得高產(chǎn)利普斯他汀的放線菌菌株GWL1.2012，也是國(guó)內(nèi)首次報(bào)道由紅樹林淤泥分離得到產(chǎn)lipstatin的菌株；通過(guò)培養(yǎng)生長(zhǎng)形態(tài)特征、生理生化特性研究以及16S rDNA 的基因序列分析比對(duì)，GWL1.2012鑒定為毒三素鏈霉菌；對(duì)菌株的發(fā)酵代謝過(guò)程及產(chǎn)物進(jìn)行了初步研究，發(fā)酵水平達(dá)到1 900 mg/L，領(lǐng)先國(guó)內(nèi)已有文獻(xiàn)報(bào)道水平；微生物來(lái)源的酶抑制劑是一類重要的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物，也成為了新型減肥藥物開發(fā)的重要途徑。菌株GWL1.2012能產(chǎn)生活性較強(qiáng)的脂肪酶抑制代謝產(chǎn)物利普斯他汀，將進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化及代謝產(chǎn)物深入研究， 有望開發(fā)為新型的減肥藥物。

參考文獻(xiàn)

[1] MELIA A T， Zh I J， ZE I R， et al. The interact ion of the liposeinhibitor orlistat with ethanol in healthy volunteers[J]. Eur J Clin Pharmacol， 1998， 54（9-10）： 773-775.

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[10] 胡為民，莊英萍，王永紅，等. 毒三素鏈霉菌生產(chǎn)利普司他汀的發(fā)酵與提取工藝[J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2007，38（10）：705-708.endprint

測(cè)與比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該菌株GWL1.2012的生化特征與毒三素鏈霉菌特征相一致，可初步鑒定為毒三素鏈霉菌（Streptomyces toxytricini）。

2.1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建與分析

菌株GWL1.2012的核糖體基因中的16S區(qū)域經(jīng)測(cè)序，長(zhǎng)度為1 437 bp，通過(guò)BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。結(jié)果顯示該序列與Streptomyces toxytricini相似性最高，為99.7%。根據(jù)放線菌16SrDNA序列在分類鑒定中的劃分依據(jù)，大于99%即可歸為同一個(gè)種，可將其鑒定為毒三素鏈霉菌。

結(jié)合GWL1.2012的生長(zhǎng)形態(tài)、生理生化特征及16SrDNA序列分析結(jié)果，菌株GWL1.2012鑒定為毒三素鏈霉菌。

2.2 搖瓶發(fā)酵初步研究

菌株GWL1.2012菌體濕重隨培養(yǎng)時(shí)間逐漸增加，0～48 h為生長(zhǎng)遲緩期，48 h后開始增長(zhǎng)加快，進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期， 60～144 h菌種生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)繁殖速度漸減，死亡數(shù)逐漸增加進(jìn)入衰亡期；從發(fā)酵開始速效碳源被快速利用pH稍有降低，24 h起開始利用遲效碳源pH逐漸上升，60～144 h菌體生長(zhǎng)階段維持在6.7～6.9，之后隨菌體也溶解衰亡pH一直升高到7.3以上，結(jié)合菌體濕重生長(zhǎng)狀態(tài)基本一致，見圖4。

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物尼泊司他汀測(cè)定

同時(shí)通過(guò)對(duì)其發(fā)酵過(guò)程的檢測(cè)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵60 h左右時(shí)，產(chǎn)物L(fēng)ipstatin開始生成，隨著菌株進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期而逐漸增加，到發(fā)酵結(jié)束時(shí)濃度達(dá)到最大值為1 900 mg/L，見圖5。

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)采集到的紅樹林淤泥進(jìn)行選擇性微生物分離，獲得高產(chǎn)利普斯他汀的放線菌菌株GWL1.2012，也是國(guó)內(nèi)首次報(bào)道由紅樹林淤泥分離得到產(chǎn)lipstatin的菌株；通過(guò)培養(yǎng)生長(zhǎng)形態(tài)特征、生理生化特性研究以及16S rDNA 的基因序列分析比對(duì)，GWL1.2012鑒定為毒三素鏈霉菌；對(duì)菌株的發(fā)酵代謝過(guò)程及產(chǎn)物進(jìn)行了初步研究，發(fā)酵水平達(dá)到1 900 mg/L，領(lǐng)先國(guó)內(nèi)已有文獻(xiàn)報(bào)道水平；微生物來(lái)源的酶抑制劑是一類重要的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物，也成為了新型減肥藥物開發(fā)的重要途徑。菌株GWL1.2012能產(chǎn)生活性較強(qiáng)的脂肪酶抑制代謝產(chǎn)物利普斯他汀，將進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化及代謝產(chǎn)物深入研究， 有望開發(fā)為新型的減肥藥物。

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[10] 胡為民，莊英萍，王永紅，等. 毒三素鏈霉菌生產(chǎn)利普司他汀的發(fā)酵與提取工藝[J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2007，38（10）：705-708.endprint

測(cè)與比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該菌株GWL1.2012的生化特征與毒三素鏈霉菌特征相一致，可初步鑒定為毒三素鏈霉菌（Streptomyces toxytricini）。

2.1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建與分析

菌株GWL1.2012的核糖體基因中的16S區(qū)域經(jīng)測(cè)序，長(zhǎng)度為1 437 bp，通過(guò)BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。結(jié)果顯示該序列與Streptomyces toxytricini相似性最高，為99.7%。根據(jù)放線菌16SrDNA序列在分類鑒定中的劃分依據(jù)，大于99%即可歸為同一個(gè)種，可將其鑒定為毒三素鏈霉菌。

結(jié)合GWL1.2012的生長(zhǎng)形態(tài)、生理生化特征及16SrDNA序列分析結(jié)果，菌株GWL1.2012鑒定為毒三素鏈霉菌。

2.2 搖瓶發(fā)酵初步研究

菌株GWL1.2012菌體濕重隨培養(yǎng)時(shí)間逐漸增加，0～48 h為生長(zhǎng)遲緩期，48 h后開始增長(zhǎng)加快，進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期， 60～144 h菌種生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)繁殖速度漸減，死亡數(shù)逐漸增加進(jìn)入衰亡期；從發(fā)酵開始速效碳源被快速利用pH稍有降低，24 h起開始利用遲效碳源pH逐漸上升，60～144 h菌體生長(zhǎng)階段維持在6.7～6.9，之后隨菌體也溶解衰亡pH一直升高到7.3以上，結(jié)合菌體濕重生長(zhǎng)狀態(tài)基本一致，見圖4。

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物尼泊司他汀測(cè)定

同時(shí)通過(guò)對(duì)其發(fā)酵過(guò)程的檢測(cè)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵60 h左右時(shí)，產(chǎn)物L(fēng)ipstatin開始生成，隨著菌株進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期而逐漸增加，到發(fā)酵結(jié)束時(shí)濃度達(dá)到最大值為1 900 mg/L，見圖5。

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)采集到的紅樹林淤泥進(jìn)行選擇性微生物分離，獲得高產(chǎn)利普斯他汀的放線菌菌株GWL1.2012，也是國(guó)內(nèi)首次報(bào)道由紅樹林淤泥分離得到產(chǎn)lipstatin的菌株；通過(guò)培養(yǎng)生長(zhǎng)形態(tài)特征、生理生化特性研究以及16S rDNA 的基因序列分析比對(duì)，GWL1.2012鑒定為毒三素鏈霉菌；對(duì)菌株的發(fā)酵代謝過(guò)程及產(chǎn)物進(jìn)行了初步研究，發(fā)酵水平達(dá)到1 900 mg/L，領(lǐng)先國(guó)內(nèi)已有文獻(xiàn)報(bào)道水平；微生物來(lái)源的酶抑制劑是一類重要的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物，也成為了新型減肥藥物開發(fā)的重要途徑。菌株GWL1.2012能產(chǎn)生活性較強(qiáng)的脂肪酶抑制代謝產(chǎn)物利普斯他汀，將進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化及代謝產(chǎn)物深入研究， 有望開發(fā)為新型的減肥藥物。

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