PSGL—1+/—；IL—2—/—小鼠模型的構(gòu)建

楊揚(yáng)等

[摘要] 目的 構(gòu)建PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型。 方法 將白介素2敲除（IL-2 KO）小鼠與P-選擇素糖蛋白配體-1敲除（PSGL-1 KO）小鼠雜交，剪尾提DNA后用PCR法檢測(cè)小鼠的基因型。 結(jié)果 IL-2 KO小鼠與PSGL-1 KO小鼠雜交三代后，PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型構(gòu)建成功。 結(jié)論 將IL-2 KO小鼠與PSGL-1 KO小鼠雜交三代后，成功建立了PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型。

[關(guān)鍵詞] P-選擇素糖蛋白配體-1；白介素-2；P-選擇素糖蛋白配體-1敲除小鼠；白介素-2敲除小鼠；動(dòng)物模型

[中圖分類號(hào)] R-332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）23-0007-03

[Abstract] Objective To construct the PSGL-1+/-；IL-2-/- mice model. Methods PSGL-1 KO mice were mated with IL-2 KO mice. Mice were genotyped by PCR after cut the tail and extracted DNA. Results After PSGL-1 KO mice being mated with IL-2 KO mice for three generations， PSGL-1+/-；IL-2-/- mice were obtained. Conclusion PSGL-1+/-；IL-2-/- mice are established through PSGL-1 KO mice being mated with IL-2 KO mice.

[Key words] PSGL-1；IL-2；PSGL-1 knockout mice；IL-2 knockout mice；Animal model

基因工程小鼠（genetically engineered mouse，GEM）是隨著細(xì)胞工程、分子生物學(xué)的發(fā)展，利用基因打靶、轉(zhuǎn)基因、嵌合體等技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠基因組有目的的改造或修飾，使小鼠有特定的特性或生物表型，以研究基因的功能、調(diào)控機(jī)制及與其他基因的相互作用等[1]。基因工程小鼠還可以作為人類的疾病模型，如自發(fā)腫瘤模型、自發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化模型等，研究疾病的發(fā)病機(jī)制和藥物研究。基因工程小鼠包括基因敲除小鼠、基因替換小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠[2，3]。本實(shí)驗(yàn)所用的兩種基因工程小鼠為基因敲除小鼠，分別是白細(xì)胞介素-2敲除小鼠（IL-2 KO mouse）和P-選擇素糖蛋白配體-1敲除小鼠（PSGL-1 KO mouse）。為了進(jìn)一步研究白細(xì)胞介素-2和P-選擇素糖蛋白配體-1在炎癥、心血管及腫瘤疾病中的共同作用，將IL-2 KO 小鼠和PSGL-1 KO 小鼠雜交建立了PSGL-1基因敲除及IL-2為雜合子的PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型。可以再利用此小鼠模型建立各種炎癥、心血管及腫瘤等疾病模型，所以此模型可作為研究PSGL-1和IL-2在炎癥、心血管和腫瘤中作用及相互關(guān)系的良好動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng) P-選擇素糖蛋白配體-1敲除小鼠（PSGL-1 KO小鼠）和白介素-2敲除小鼠（IL-2 KO小鼠）購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室，共4只，雌雄各2只，周齡6～8周。小鼠在SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)，動(dòng)物房溫度控制在22℃～28℃，濕度為50%～70%，并且保持12 h明/12 h暗。小鼠的飼料購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心并經(jīng)60Co輻照滅菌的全營(yíng)養(yǎng)飼料。飲用水高壓滅菌。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間為2013年6月～2014年3月。

1.1.2 試劑 PCR引物由廣州英駿公司合成，蛋白酶K及dNTP購(gòu)自Sigma公司，Taq酶、Tris飽和酚及氯仿從廣州康龍公司訂購(gòu)。

1.2 方法

1.2.1 IL-2基因的鑒定 突變型IL-2引物的序列：TCG AAT TCG CCA ATG ACA AGA CGC T；野生型IL-2引物的序列：CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT；通用引物序列：GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC ATC C。PCR反應(yīng)條件：94℃變性3 min，94℃ 30 s，64℃ 45 s，72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)，72℃2 min充分延伸。在500 bp處有一條帶為IL-2純合子的小鼠，在342 bp處有一條帶為野生型小鼠，在500 bp和324 bp處各有一條帶為雜合子小鼠。

1.2.2 PSGL-1基因的鑒定 野生型PSGL-1基因引物序列：P1：5'-TCAAAA TC GTCATCCCCAAC -3，P2：5'-AGCTTCCTT GTGCTGCTGAC -3''；突變型PSGL-1基因引物序列：P1：5'-CCTT CTAT CGCC TTCT TGA CG-3'，P2：5'-TCAAAA TCGTCA TCCCCAAC-3'。PCR反應(yīng)的條件：94℃變性5 min，94℃30 s，65℃ 1 min，72℃ 1 min，循環(huán)35次；72℃延伸2 min。PSGL-1基因敲除的純合子小鼠在500 bp處有一條帶，PSGL-1基因?yàn)殡s合子的小鼠在140 bp和500 bp處各有一條帶。

1.2.3 PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型的構(gòu)建 用IL-2 KO 雄性小鼠與PSGL-1 KO雌性小鼠雜交，第一代小鼠PSGL-1和IL-2基因均為雜合子，用PSGL-1+/-；IL-2+/-雄性小鼠與IL-2 KO雌性小鼠或者用PSGL-1+/-；IL-2+/-雌性小鼠與IL-2 KO雄性小鼠再進(jìn)行雜交，在第二代可得到PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠。endprint

2 結(jié)果

2.1 IL-2 KO小鼠與PSGL-1 KO小鼠雜交情況

IL-2 KO 雄性小鼠與PSGL-1 KO雌性小鼠以1∶2的比例雜交兩籠，所生小鼠IL-2和PSGL-1基因全部為雜合子，共獲得24只。用第一代小鼠與IL-2 KO 小鼠雜交，第二代共獲得小鼠136只，其中PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠38只。

2.2 PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠的鑒定結(jié)果

把PSGL-1 KO小鼠和IL-2 KO小鼠雜交，在第三代小鼠中，1、3號(hào)和4號(hào)小鼠為PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠，2號(hào)小鼠為PSGL-1+/-；IL-2+/-小鼠。圖1A中的5號(hào)小鼠為PSGL-1基因的陽(yáng)性對(duì)照，圖1B中的5號(hào)小鼠為IL-2基因的陽(yáng)性對(duì)照。

3討論

白介素-2（IL-2）是由Morgan等在1976年發(fā)現(xiàn)的由T淋巴細(xì)胞分泌的一種因子，主要由活化的Ⅰ型輔助淋巴細(xì)胞分泌，主要功能是刺激T細(xì)胞的增生，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖；還促進(jìn)NK細(xì)胞和B細(xì)胞的活化、增殖；促進(jìn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生和增殖等[4-6]。白介素-2還可以促使NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子和干擾素等，而且目前已廣泛應(yīng)用于抗炎和抗腫瘤治療[7-10]。

P-選擇素糖蛋白配體-1（P-selectin glycoprotein ligand-1， PSGL-1）是一種粘附分子，在幾乎所有類型的白細(xì)胞表面表達(dá)，是選擇素的配體[11-14]。因此，PSGL-1與表達(dá)于白細(xì)胞的L-選擇素及表達(dá)于活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞的E-選擇素和P-選擇素相互作用，從而介導(dǎo)白細(xì)胞的黏附[15，16]。由于白細(xì)胞黏附與炎癥、凝血、傷口修復(fù)及腫瘤轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，因此PSGL-1介導(dǎo)的白細(xì)胞黏附作用可在多種生理和病理過程中發(fā)揮重要的作用。

IL-2敲除小鼠是由Ivan Horak等在1991年構(gòu)建成功的，IL-2純合子敲除小鼠在4～9周時(shí)會(huì)出現(xiàn)脾、淋巴結(jié)腫大、腸道炎癥及貧血等疾病的癥狀。由于白介素-2與PSGL-1在炎癥、腫瘤等疾病中都發(fā)揮重要作用，為了探索兩者是否具有協(xié)同或拮抗作用，本實(shí)驗(yàn)將白細(xì)胞介素-2敲除小鼠和黏附分子P-選擇素糖蛋白配體基因敲除小鼠雜交建立了PSGL-1基因敲除及IL-2為雜合子的PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型，在飼養(yǎng)的過程中，由于PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠的免疫力會(huì)降低，易感染，因此在飼養(yǎng)的過程中對(duì)無菌的要求會(huì)更加嚴(yán)格，小鼠必須飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中，飲用水及飼料必須是無菌的。可以利用此小鼠模型建立各種炎癥、心血管、自身免疫性疾病及腫瘤模型，也為研究PSGL-1和IL-2在炎癥、心血管和腫瘤疾病中的作用及相互關(guān)系提供了良好的動(dòng)物模型。

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