氯化鋰介導經典Wnt/β-catenin信號通路在大鼠脂肪干細胞增殖和成骨中的作用

趙 璇，徐 燕，鄭桂婷，沈繼龍

氯化鋰介導經典Wnt/β-catenin信號通路在大鼠脂肪干細胞增殖和成骨中的作用

趙 璇1，徐 燕1，鄭桂婷1，沈繼龍2

目的 探討在體外生長環境下不同濃度氯化鋰對脂肪干細胞（ADSCs）增殖和成骨分化的作用及其可能的機制。方法 ①從3周齡SD大鼠腹股溝脂墊分離出脂肪組織，使用0.1%Ⅰ型膠原酶消化后置于含10%胎牛血清DMEM培養，以 0、2.5、5、10、20、40 mmol/L 濃度的氯化鋰作用 ADSCs 24、48、72 h，用 MTT法測定氯化鋰對細胞增殖的作用;②ADSCs加入含0、2.5、5、10、20、40 mmol/L 氯化鋰的成骨培養液中培養7 d后測定細胞中堿性磷酸酶（AKP）的活性;③用RT-PCR法檢測成骨誘導3 d后，不同濃度氯化鋰作用7 d時ADSCs中β-catenin、糖原合成激酶3β、AKP的表達。結果

在體外環境培養下，低濃度氯化鋰（2.5、5、10 mmol/L）促進干細胞增殖，高濃度氯化鋰（20、40 mmol/L）抑制細胞增殖。5、10 mmol/L氯化鋰促進ADSCs中AKP的活性，但是40 mmol/L具有明顯抑制AKP活性的作用。同時，氯化鋰能上調β-catenin和AKP的表達。結論 氯化鋰在體外對大鼠ADSCs增殖有雙重影響，并且促進AKP活性和ADSCs成骨分化，具有劑量依賴性。5 mmol/L 濃度的氯化鋰可作為促進大鼠ADSCs增殖和成骨分化的最適濃度。

Wnt信號通路;脂肪干細胞;氯化鋰;增殖;成骨分化

脂肪干細胞（adiposed-derived stem cell，ADSCs）由 Zuk et al［1］于2001年發現，因其易取得、儲量豐富性、自我增殖和多向分化的能力強等特點在牙周組織工程中引起關注［2］。Wnt信號通路參與細胞的增殖、分化、遷移、基因表達等各項活動［3］，特別是經典的Wnt/β-catenin信號通路更是對干細胞的增殖和分化起到關鍵性的作用。該研究旨在使用不同濃度氯化鋰對ADSCs進行刺激，探討經典Wnt/βcatenin通路對于ADSCs增殖和成骨向分化的作用以及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級3周齡SD大鼠，體重50 g，雌雄不限，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 主要儀器、試劑 DMEM、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶（HyClone公司，美國）;Ⅰ型膠原酶、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、地塞米松、氯化鋰、MTT（Sigma公司，美國）;堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）試劑盒（南京建成生物工程研究所）;TRIzol（Life Technologies公司，美國）;逆轉錄試劑盒、第一鏈cDNA合成試劑盒（MBI Fermentas公司，加拿大）;DNA Marker（TaKaRa公司，日本）;倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）;ELX808U酶標儀（伯騰儀器，美國）;Nikon eclipse 80i成像系統（尼康株式會社，日本）;PCR儀（BIO-RAD公司，美國）;高速冷凍離心機（日本株式會社，日本）。

1.3 方法

1.3.1 ADSCs分離、培養以及傳代 SD大鼠ADSCs的分離主要采用酶消化法，無菌取大鼠腹股溝區脂肪墊，PBS漂洗2～3次后去除組織表面的筋膜、血管，剪碎至糊狀移至50 ml離心管。加入0.1% Ⅰ型膠原酶于管中，37℃消化30～40 min后加入含10%FBS的DMEM液終止消化，2 500 r/min離心5 min。離心結束后吸去最上層的油脂及中層的DMEM，僅保留下層脂肪細胞，加入5 ml含10%FBS的DMEM液重懸細胞。以200目細胞篩過濾，并加入適量的紅細胞裂解液，37℃孵育10 min裂解紅細胞。再次800 r/min離心5 min后棄上清液，PBS漂洗后離心取細胞沉淀，5 ml含10%FBS的DMEM液重懸細胞并接種于培養瓶中，37℃、5%CO2孵箱培養，48 h后首次換液，以后每3 d換液1次，待細胞匯合至80%用PBS洗滌3次，加入0.25%的胰蛋白酶（含0.01%EDTA），當細胞由梭形變為圓形從瓶上脫落，用含10%FBS的DMEM液終止消化，吹打均勻并以1∶3比例傳代。傳至第3代備用。

1.3.2 MTT法檢測 取對數生長期細胞消化制備成單細胞懸液，密度為4 000個/孔接種于96孔板培養，待細胞長成單層換成含氯化鋰終濃度為0、2.5、5、10、20、40 mmol/L 的新鮮無血清培養液培養，每個濃度平行接種3孔，在第1、2、3天時檢測，每孔加入 0.5%MTT 20 μl/孔，37 ℃ 孵育 4 h后，去除MTT，加入二甲基亞砜150 μl，低速震蕩90 r/min約10 min后，在492 nm處酶標儀讀出吸光度值（OD492），實驗重復3次。

1.3.3 AKP活性檢測 將對數生長期的細胞按4 000個/孔接種于96孔板內，24 h后更換含不同濃度氯化鋰的成骨培養液，分為對照組（0 mmol/L）和實驗組（2.5、5、10、20、40 mmol/L），作用 7 d 后檢測每組細胞AKP的活性。每組設3個復孔。收集細胞后，依照試劑盒說明書檢測，在酶標儀520 nm波長處讀取數值。實驗重復3次。

1.3.4 RT-PCR法檢測Wnt信號通路組成以及成骨相關基因的表達 將細胞接種于6孔板中，分為對照組和實驗組（氯化鋰濃度為 2.5、5、10、20、40 mmol/L），成骨誘導3 d后氯化鋰處理7 d，TRIzol一步法提取總RNA;分光光度法測量RNA的濃度以及純度。使用Thermo逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA。PCR產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳后，用紫外透射分析儀觀察并且拍照，分析各個條帶積分光密度（intergrated option density，IOD），計算相對于GAPDH的相對表達量。實驗重復3次。引物由上海生工生物工程公司合成。見表1。

表1 mRNA擴增引物名稱、核苷酸序列及產物大小

1.4 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件進行分析，數據以±s表示，組間均數比較采用單因素方差（ANOVA）分析，兩組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 ADSCs形態學 在倒置顯微鏡下觀察，原代細胞剛接種時是懸浮于培養液中，24 h后小部分細胞零散貼壁，形態呈短梭形、三角形等，6～7 d后細胞體積增大，形態逐漸變化為長梭形，類似于成纖維細胞，呈漩渦狀生長。當細胞傳代次數增加，形態趨于均一，主要為梭形。見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下第3代ADSCs形態 ×100

2.2 氯化鋰對ADSCs增殖的影響 第1天氯化鋰對各組作用效果不顯著，各組差異無統計學意義。第2、3天氯化鋰作用效果較明顯，低濃度氯化鋰（2.5、5、10 mmol/L）可以引起大鼠 ADSCs有絲分裂，有利于細胞增殖，第3天時效果顯著;高濃度氯化鋰（20、40 mmol/L）抑制細胞的增殖。見圖2。

圖2 不同濃度氯化鋰對大鼠ADSCs增殖的影響（n=3，±s）

表2 不同濃度氯化鋰對大鼠脂肪干細胞AKP活性的影響（n=3，±s）

表2 不同濃度氯化鋰對大鼠脂肪干細胞AKP活性的影響（n=3，±s）

與對照組（0 mmol/L）比較:*P＜0.05

氯化鋰（mmol/L） AKP活性（U/100 ml）2.330 ±0.520 2.5 2.903 ±0.527 5 4.616 ±0.732*10 3.346 ±0.629*20 2.070 ±0.585 40 1.443 ±0.130 0*

2.3 AKP活性檢測 大鼠ADSCs經過氯化鋰處理7 d后檢測，與對照組比較，5、10 mmol/L組對細胞AKP活性的促進作用較顯著。見表2。

2.4 RT-PCR 檢測 與對照組比較，β-catenin的mRNA表達量隨著氯化鋰濃度的升高而上升（F=64.74）。GSK-3β的mRNA表達量隨著氯化鋰濃度的升高而降低（F=47.51）。AKP mRNA表達在5 mmol/L組時最高，隨后依次下降（F=68.83）。見圖3。

圖3 不同濃度氯化鋰作用ADSCs 7 d后mRNA的表達

3 討論

脂肪干細胞被認為是牙周組織再生技術中具有重大潛力的干細胞之一，因其有取材便利，儲量大，低免疫原性，自身可分泌多種生長因子等多個優勢［4］。干細胞體外增殖和成骨向分化在不同成骨階段涉及多個信號通路的調節，其中包括Wnt/βcatenin信號通路、絲裂原活化蛋白激酶途徑、Notch信號通路途徑、骨形態發生蛋白途徑等［5－6］。Wnt/β-catenin途徑是研究較多的經典Wnt信號轉導途徑，Wnt信號配體可以同跨膜蛋白低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6以及細胞膜上七次跨膜的卷曲蛋白受體（Frizzled、Fzd）結合，隨后Fzd胞內區域作用于蓬松蛋白（Dishevelled、Dsh或Dvl），Dvl的活化可抑制由細胞支架蛋白Axin、GSK-3β、腺瘤樣結腸息肉病基因（adenomatous polyposis coli，APC）編碼的蛋白組成的降解復合體對β-catenin的磷酸化，避免其降解，讓β-catenin在細胞質中穩定積累，隨后進入細胞核內激活轉錄因子（T-cell-specific transcription factor，TCF）/淋巴增強因子（lymphoid enhancing factor，LEF），形成 β-catenin-TCF/LEF 二聚體，從而激活下游靶基因如AKP轉錄與表達，此時信號通路被激活［7］。

氯化鋰是被廣泛應用的GSK-3β無機離子抑制劑，能通過抑制鉀的丟失或者與鎂競爭，使絲氨酸N端結構域被磷酸化，抑制 GSK3β 的活性［8］，阻止Axin-APC-GSK-3β降解復合體的形成，促使β-catenin在細胞質內大量聚集從而激活通路［7］。氯化鋰能通過經典的Wnt/β-catenin信號通路促進人視網膜母細胞瘤細胞系細胞和人骨髓來源間充質干細胞的增殖［6，9］。本研究顯示氯化鋰對增殖的影響是具有劑量依賴性的，ADSCs在2.5～10 mmol/L濃度作用時促進細胞增殖，而作用的濃度升高時（20、40 mmol/L）對細胞具有毒性，抑制增殖。40 mmol/L時細胞不僅增殖緩慢，形態也發生變化，不是呈長梭形而是向周圍伸展，并且變得較扁平，細胞之間接觸松散不緊密。說明可以選擇2.5～10 mmol/L的氯化鋰，對脂肪干細胞增殖具有促進作用。

AKP是早期成骨分化的特異性標志物［10］。AKP活性檢測結果表明5、10 mmol/L氯化鋰能夠有效提高細胞AKP的活性。早期研究［11］顯示在小鼠多能干細胞系C3H10T1/2細胞中，氯化鋰能通過活化內源性的 β-catenin或者異位表達穩定的βcatenin來激活 Wnt/β-catenin信號通路，誘導 AKP mRNA的表達，在成骨前體細胞和成骨細胞增殖和分化中發揮作用。在大鼠和人的骨髓間充質干細胞中也能促進細胞成骨向分化［12－13］。Han et al［10］使用氯化鋰活化Wnt/β-catenin信號通路能促進牙周膜干細胞中AKP、OPN基因的表達。根據這些研究結果，本實驗選擇氯化鋰作為有效激活Wnt/β-catenin信號通路的激活劑，來觀察不同濃度氯化鋰對大鼠ADSCs成骨向分化的作用。RT-PCR實驗結果顯示隨著氯化鋰濃度增高，GSK-3β的mRNA表達量逐漸減少，β-catenin的mRNA表達量增加，說明氯化鋰有效抑制了GSK-3β對于β-catenin的磷酸化，激活了Wnt/β-catenin信號通路。AKP的表達在5 mmol/L組最高，隨后依次減少。實驗結果說明氯化鋰有效作用于Wnt/β-catenin信號通路，調控相關基因的表達并且具有劑量依賴性，可能由于氯化鋰對GSK-3β具有雙重抑制的作用而影響信號通路的激活，適當的部分抑制GSK-3β是有益處的，但是大量抑制其功能可能是具有毒性的［8，14］。

綜上所述，氯化鋰作為經典Wnt/β-catenin信號通路的激活劑，在ADSCs增殖和成骨向分化中起到重要作用，5 mmol/L的氯化鋰可以作為同時促進ADSCs增殖和成骨向分化的適宜濃度，為今后牙周組織工程中骨再生研究提供了依據，但其作用的具體機制尚需進一步研究。

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Effect of Lithium chloride mediated canonical Wnt/β-catenin signaling on proliferation and osteogenic differentiation of rat adiposed-derived stem cells

Zhao Xuan，Xu Yan，Zheng Guiting，et al
（Dept of Periodontal Oral Medicine，Stomatologic Hospital of Anhui Medical University，Key Lab of Oral Diseases Research of Anhui Province，Hefei230032）

ObjectiveTo investigate the effect of different concentrations of Lithium chloride on proliferation and osteogenic differentiation of rat adiposed-derived stem cell（ADSCs）in vitroculture and its possible mechanism.Methods① The ADSCs were harvested from the fat pad in the groin of 3-week-old rats，then maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10%fetal bovine serum after digesting with 0.1%collagenase type Ⅰ.ADSCs were exposed to Lithium chloride at 0，2.5，5，10，20，40 mmol/L for 24，48 and 72 hours.The effect of Lithium chloride on cells proliferation was determined by MTT assay.② Alkaline phosphatase（AKP）activity in cells was detected after ADSCs cultured for 7 days in osteogenic differentiation medium in 2.5，5，10，20，40 mmol/L or with no Lithium chloride.③ The ADSCs were treated with different concentrations of Lithium chloride for 7 days after treating with osteogenic differentiation medium for 3 days，and the expressions of β-catenin，glycogen synthase kinase-3β，AKP were detected by using RT-PCR method.ResultsIn vitro，low doses of Lithium chloride（2.5，5 and 10 mmol/L）sitimulated ADSCs proliferation，whereas high doses caused a inhibition of proliferation.5 and 10 mmol/L Lithium chloride induce AKP activity in ADSCs which were induced the differentiation towards osteolasts，however 40 mmol/L significantly inhibited AKP activity.Meanwhile，Lithium chloride upregulated the expression of β-catenin and AKP.ConclusionIn vitro，Lithium chloride has a dual effect on ADSCs proliferation，and it improves AKP activity as well as promoting osteogenic differentiation in a dose-dependent manner.5 mmol/L Lithium chloride can be used as the optimum concentration for stimulating cell proliferation and promoting osteogenic differentiation in rat ADSCs.

Wnt/β-catenin signaling pathway;adiposed-derived stem cell;Lithium chloride;proliferation;osteogenic differentiation

R 781.4

A

1000－1492（2014）05－0590－05

2014－01－05接收

安徽省自然科學基金（編號:1308085MH130）

1安徽醫科大學口腔醫學院，安徽醫科大學附屬口腔醫院，安徽醫科大學附屬省口腔醫院牙周黏膜科，安徽省口腔疾病研究中心實驗室，合肥 230032

2安徽省病原生物學省級實驗室和人獸共患病安徽省重點實驗室，合肥 230032

趙 璇，女，碩士研究生;

徐 燕，女，教授，副主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail:173236344@qq.com