不同表型表皮葡萄球菌之間的相互作用及LuxS基因對生物膜形成的影響

王賢聰，劉 寶，周樹生，曹曉光，戴媛媛

不同表型表皮葡萄球菌之間的相互作用及LuxS基因對生物膜形成的影響

王賢聰1，劉 寶1，周樹生1，曹曉光1，戴媛媛2

目的 探討不同表型的表皮葡萄球菌（SE）之間的相互作用機制以及luxS基因在SE形成生物膜過程中所起的作用。方法 分別應用TSB培養液、ATCC12228上清液以及ATCC35984上清液培養產生生物膜的SE標準菌株ATCC35984和不產生生物膜的ATCC12228菌株，并采用半定量法檢測細菌間多糖黏附素（PIA）以及半定量PCR法檢測LuxS基因在該菌株中的表達。結果 在TSB培養液中，ATCC35984菌株能形成致密完整的生物膜，而ATCC12228菌株不能產生生物膜。在ATCC35984上清液中，ATCC12228菌株形成生物膜的能力增強，LuxS基因表達降低。在ATCC12228菌株上清液中，ATCC35984產生生物膜能力下降，LuxS基因表達增強，兩者比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論 LuxS基因在SE形成生物膜的過程中起一定作用，并且不同表型的SE之間存在相互影響的現象。

QS系統;LuxS基因;半定量PCR;表皮葡萄球菌

群體感應信號（quorum sensing，QS）系統是細菌間通過分泌和探測化學信號分子－自體誘導分子（auto inducers，AIs）來監測群體密度，協調細菌生物功能的信息交流機制［1］。QS系統由AIs、感應分子及下游調控蛋白構成，根據細菌合成的信號分子和感應機制不同，QS系統分為革蘭陰性菌的酰基高絲氨酸內酯（acylated homoserine lactones，AHL）系統、革蘭陽性菌中寡肽介導的雙組分感應系統以及種內及種間依賴LuxS/AI-2的QS系統調節。當信號分子達到一定閾值濃度時，該信號分子與細菌表面的相關受體結合，激活下游相關靶基因調節細菌生物學性狀，如生物膜形成、毒力的產生及生物發光等［2］。研究［3］顯示，在同一菌種內及不同菌種間存在共同的信號分子－AI-2來介導細菌之間的信息交流，該信號是由LuxS基因編碼的LuxS蛋白酶催化產生，并通過下調生物膜胞外多糖來降低細菌之間的黏附。現對不同表型表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，SE）中LuxS/AI-2群體感應信號系統進行研究，探討LuxS基因在SE形成生物膜過程中的作用，以及不同SE菌種之間的相互作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 SE標準菌株ATCC35984［多糖黏附素（polysaccharide intercellular adhesin，PIA）表型陽性，生物膜表型陽性］和 SE標準菌株ATCC12228（PIA表型陰性，生物膜表型陰性）均購于美國ATCC公司。

1.1.2 試劑與儀器 TSB培養液購于英國 Oxiod公司;PCR引物購于上海捷瑞生物工程有限公司;RNA提取試劑盒購于美國Promega公司;逆轉錄試劑盒及PCR試劑盒購于大連TaKaRa公司;溶菌酶、葡萄球菌溶素購于美國Sigma公司;PCR儀購于德國Tgradient Biometra公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌上清液提取及分組 將血平板上SE單個菌落接種到5 ml TSB培養液中，搖菌培養（37℃，100 r/min）8 h，4 000 r/min 離心 30 min，取上清液，并將上清液進行涂片，革蘭染色后鏡檢，無細菌為合格上清液，－80℃冰箱凍存備用。該研究分別命名 SE ATCC35984上清液為上清液 1，SE ATCC12228上清液為上清液2。將提取的上清液相互交叉加樣，共分為 3組，分別為:A組 SE ATCC35984菌株組（對照組A1:用TSB培養;實驗組A2:用上清液2培養）、B組SE ATCC12228菌株組（對照組B1:用TSB培養;實驗組B2:用上清液1培養）及C組空白對照組（對照組C1:TSB液;對照組C2:上清液1;對照組C3:上清液2）。

1.2.2 剛果紅瓊脂法PIA定性檢測 將心腦浸液肉湯18.5 g、蔗糖25 g、瓊脂5 g及剛果紅0.4 g溶于蒸餾水500 ml，121℃，高壓滅菌20 min制備剛果紅平板。分別將對照菌株及實驗菌株搖菌培養（37℃，100 r/min）過夜，轉種至剛果紅平板中，37℃培養24 h，觀察結果。

1.2.3 半定量法檢測細菌生物膜 參照文獻［4］方法，將血平板中單個菌落接種于5 ml TSB培養液中，調成0.5麥氏度，搖菌培養（37℃，100 r/min）過夜。分別將 A1和 A2組菌液用 TSB培養液作1∶100稀釋，實驗組A2使用上清液2液按1∶100稀釋，實驗組B2菌液使用上清液1作1∶100稀釋后，加入96孔培養板中，每株細菌接種6個平行孔，每孔200 μl。在該培養板中分別接種TSB培養液、上清液1、上清液2各200 μl作為對照。將96孔培養板37℃培養24 h后，蒸餾水洗板3次，晾干，每孔0.1%結晶紫200 μl染色5 min，蒸餾水洗板3次，晾干，用酶標儀在570 nm波長比色，計算每株細菌的平均吸光度（optical density，OD）值。

1.2.4 RT-PCR法檢測LuxS基因表達 分別將對照菌株及實驗菌株振搖培養（37℃，100 r/min）12 h，加入5 μl溶葡萄球菌酶，繼續振搖培養6 h，離心收集細菌，按RNA提取試劑盒說明書提取細菌總RNA。取5 μl總RNA按照逆轉錄試劑盒說明，進行逆轉錄合成cDNA，－20℃凍存備用。取4 μl cDNA作為模板用于PCR擴增（總反應體系50 μl）。引物序列及長度:LuxS上游引物:5'-CAATAAGGAGGATGTCGACATGACATGACTAAAATGAATG-3'，下游引物:5'-TTAGTTGTATTGTCTGCAGTTTACCTTCTCCGTAG-3'，582 bp;內參基因 β-actin 上游引物:5'-CGTGCTACAATGGACAATACAAA-3'，下游引物:5'-ATCTACGATTACTAGCGATTCCA-3'，185 bp。PCR 反應條件:94 ℃ 4 min、94 ℃ 30 s、57.2 ℃ 30 s、72℃ 1 min循環33次，72℃ 5 min。將PCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳，拍照記錄結果。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，數據以±s表示，組間比較采用t檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 不同表型的SE菌落在剛果紅平板上的生長情況 在對照組A1中，SE ATCC35984菌株菌落在剛果紅平板上呈黑色、光亮、干燥菌落，提示為高產PIA菌株，而在實驗組A2中，該菌株菌落為底黑酒紅色，說明該菌株產生生物膜能力下降。在對照組B1中，菌株菌落在剛果紅平板上呈紅色光滑菌落，而實驗組B2菌株在剛果紅平板上呈底黑酒紅色，見圖1。

圖1 不同表型SE菌株在剛果紅培養基上生長情況

2.2 不同表型的SE經不同培養基培養后在96孔板中產生生物膜情況 對照組A1中菌株形成較厚且致密的生物膜，而實驗組A2中菌株形成的生物膜較薄，比較稀疏。兩組菌株OD值之間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。對照組B1中菌株不能形成生物膜，而經上清液1培養的實驗組B2菌株能形成明顯的生物膜，兩組菌株OD值之間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。另其他C組空白對照組中 TSB培養液、SE ATCC35984上清液、SE ATCC12228上清液均不能形成生物膜，見圖2、表1。

圖2 不同表型SE菌株在96孔板中形成生物膜情況

表1 不同表型SE在96孔板中形成生物膜的OD值（±s）

表1 不同表型SE在96孔板中形成生物膜的OD值（±s）

菌株（SE） 組別 OD值 t值 P值ATCC35984 對照組 A11.578 ±0.12914.066 0.00實驗組 A2 2.652 ±0.136 ATCC12228 對照組 B1 0.106 ±0.007 10.929 0.00實驗組B2 0.977 ±0.195

2.3 RT-PCR法檢測目的基因 在4組菌株中LuxS均有表達，在582 bp處可見一組亮色條帶。但在對照組（A1和B1）中，SE ATCC12228菌株條帶比SE ATCC35984菌株條帶亮度明顯增加，其吸光度比值比較差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗組A2 SE ATCC35984菌株條帶亮度較對照組A1有所增加，其吸光度比值比較差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗組B2 SE ATCC12228菌株條帶亮度較對照組B1減弱，其吸光度比值比較差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 RT-PCR法檢測LuxS基因在不同表型SE中表達水平

3 討論

LuxS/AI-2密度感應系統是在研究一種海洋微生物哈氏弧菌首次被發現的，哈氏弧菌不僅能感應AI-1類信號分子，還能通過感應AI-2類信號分子來調節生物發光。McNab et al［5］發現在兩種口腔微生物聯合起來形成混種生物膜入侵牙周組織的過程中，LuxS/AI-2密度感應系統種間調節起關鍵作用。在實驗組A2中，經SE ATCC12228上清液培養的SE ATCC35984菌株形成生物膜的能力大大下降，反之，在實驗組 B2中不能形成生物膜的 SE ATCC12228菌株通過高產生物膜SE ATCC35984上清液培養后，具有了形成生物膜的能力。由此推測，該現象產生的原因可能是由于加入的上清液中存在AI-2信號系統，從而使原菌株的生物學行為發生趨向性的轉變。Karim et al［6］發現，通過加入純化的外源性AI-2信號，一種致牙周病的細菌同源菌株的突變株能夠形成致密的生物膜。

Xu et al［7］構建了 SE LuxS 基因同源突變株，與野生株相比，LuxS突變株更容易形成更厚更致密的生物膜，并且容易導致動物模型中導管相關性感染。LuxS基因可能通過調控ica基因位點轉錄影響PIA產生，從而影響生物膜的產生。本研究表明在高產PIA的SE菌株其LuxS基因表達降低，反之在低PIA菌株其LuxS基因表達增高。在實驗組A2中的SE ATCC35984菌株形成生物膜的能力有所下降，但是沒有完全失去形成生物膜的能力，而實驗組B2中SE ATCC1222菌株形成的生物膜的厚度遠遠小于對照組A1。由此推測，在培養的早期，由于培養液中存在AI-2信號，菌株上相應的受體與AI-2信號分子結合，調節一系列的生物學效應，但隨著細菌不斷繁殖，原有的AI-2信號不斷消耗，無法達到一定的閾值，而不能進一步調控細菌生物膜的產生。但LuxS/AI-2密度感應系統是如何調控細菌生物膜的機制仍不清楚，需要進一步研究證實。

綜上所述，LuxS/AI-2密度感應系統在表皮葡萄球菌形成生物膜過程中起重要調節作用。目前由于多重耐藥菌的產生，迫切需要一種新的替代方法來控制致病菌。大多數細菌均通過QS系統來調節細菌生物學行為，因此通過干擾細菌的該系統有望成為一種新型有效的抗菌手段。

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［3］McNab R，Lamont R J.Microbial dinner-party conversations:the role of LuxS in interspecies communication［J］.J Med Microbiol，2010，52（7）:541－5.

［4］Bemado D H，Fortino S S，Blanca L M，et al.Production oficaADBC-encoded polysaccharide intercellular adhesion and therapeutic failure in pediatric patients withstaphulococcaldevice-related infections［J］.BMC Infect Dis，2010，10（68）:1－ 6.

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［6］Karim M M，Hisamoto T，Matsunaga T，et al.LuxS affects biofilm maturation and detachment of the periodontopathogenic bacteriumEikenella corrodens［J］.J Biosci Bioeng，2013，116（3）:313－8.

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The interaction of different phenotypeStaphylococcus epidermidisand the influence of Luxs gene on biofilm formation

Wang Xiancong，Liu Bao，Zhou Shusheng，et al
（Dept of ICU，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei230001）

ObjectiveTo investigate the interaction mechanisms between the different phenotype ofStaphylococcus epidermidisand the role of LuxS in the process of biofilm formation.MethodsSE ATCC35984 with the ability of biofilm formation and SE ATCC12228 without this ability was cultured respectively with TSB medium，SE ATCC12228 supernatant and SE ATCC35984 supematant.After 18h，polysaccharide intercellular adhesion and the expression of LuxS in the strain were detected by semi-quantitative method and semi-quantitative PCR method.ResultsThe strain of SE ATCC35984 cultured by TSB formed dense and compact biofilm，while the strain of SE ATCC12228 was unable to produce biological membrance.Cultured by SE ATCC35984 supematant，the ability of SE ATCC12228 biofilm formation was increased，and the expression of LuxS in the strain was reduced.Similarly，the biofilm formation ability was reduced and the expression of LuxS was increased in the strain of SE ATCC35984 cultured by ATCC12228 supernatant.The differences among these groups were significant（P＜0.05）.ConclusionLuxS plays a key role in the process of biofilm formation ofStaphylococcus epidermidis，and the different phenotype ofStaphylococcus epidermidisinteract with each other.

QS system;LuxS;semi-quantitative PCR;Staphylococcus epidermidis

R 378.11

A

1000－1492（2014）05－0610－04

2013－11－25接收

安徽省教育廳課題基金資助項目（編號:KJ2009B001Z）

安徽醫科大學附屬省立醫院1ICU、2細菌室，合肥230001

王賢聰，男，碩士研究生;

劉 寶，男，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail:linux306@126.com