宮內暴露鄰苯二甲酸二酯對子代雌性成年大鼠心臟的影響

趙青松，方 瑞，吳 德，都鵬飛

宮內暴露鄰苯二甲酸二酯對子代雌性成年大鼠心臟的影響

趙青松1，方 瑞2，吳 德1，都鵬飛2

目的 探討鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）宮內暴露對子代雌性大鼠心臟的影響。方法 自妊娠第1天直至分娩，SD妊娠大鼠分別予以灌胃玉米油、低劑量［10 mg/（kg·d）］DEHP、高劑量［100 mg/（kg·d）］DEHP。觀察各組子代雌性大鼠一般狀況（體重）、心肌組織學以及心臟的血流動力學指標。結果 ①與正常對照組比較，DEHP染毒組雌性仔鼠自出生至生后70 d的體重增長明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）。② 高劑量組的心率（HR）、左室舒張壓（LVEDP）明顯高于正常對照組及低劑量組，而左室收縮壓（LVSP）、左室最大上升速率（+dp/dtmax）及左室最大下降速率（－dp/dtmax）明顯低于正常對照組及低劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05）。③ 光鏡下高劑量組子代雌性大鼠的心肌細胞肥大，心肌纖維排列紊亂，大量心肌細胞核核固縮、深染;電鏡示大量心肌細胞核固縮、深染，心肌纖維排列紊亂、斷裂，線粒體嵴排列大部分斷裂、模糊。然而，正常對照組和低劑量組病理變化不明顯。結論 懷孕期間大劑量的DEHP接觸可引起子代雌性大鼠體重增加、血流動力學異常和心肌細胞結構紊亂。

鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯;胚胎期;心肌細胞;心功能

鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯［Di（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP］是一種工業上添加到聚氯乙烯中使用最廣和產量最大的塑化劑，占全世界鄰苯二甲酸酯類消費的80%［1］，在成品塑料中占據40%的比例。DEHP被廣泛應用在食品包裝、玩具、化妝品和醫療制品等眾多領域，可通過皮膚接觸、消化道和呼吸道被吸收［2］，也可以通過胎盤屏障影響胎兒。DEHP作為一種環境內分泌干擾物（environmental endocrine disrupters，EEDs），其生殖毒性已經得到研究者的公認。但DEHP對心肌細胞及心臟功能的影響報道甚少。該研究主要通過胚胎期暴露于不同劑量的DEHP，觀察子代雌性大鼠心臟組織形態學及測定其血流動力學，為今后DEHP心臟毒性的研究及干預提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 DEHP:分析純，純度98.6%（美國Sigma公司）;玉米油:市售，金龍魚牌;BL-420s生物機能試驗系統、壓力換能器（成都泰盟科技有限責任公司）;Tecnai F20透射電子顯微鏡（中國科技大學集成影像中心）。

DEHP染毒溶液的配置:用移液管分別吸取1 ml DEHP，用玉米油分別稀釋100倍、10倍，顛倒混勻，配置成10、100 mg/ml的DEHP溶液。

1.2 實驗動物分組及染毒方法 選擇健康成年清潔級SD大鼠9只，體重為220～250 g，雌 ∶雄為2∶1，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。動物可自由飲水、攝食，飼料由安徽醫科大學實驗動物中心提供。動物室溫度為18～23℃，相對濕度為45%～55%。適應性飼養7 d后，將大鼠按雌雄2∶1進行合攏后，以發現陰栓當日為妊娠第1天，將孕鼠按體重隨機分為3組:正常對照組、低劑量（10 mg/kg）DEHP染毒組、高劑量（100 mg/kg）DEHP染毒組。根據大鼠生活習性，自妊娠第1天起，8∶00禁食，14∶00灌胃染毒DEHP，正常對照組予以玉米油灌胃，容量均為2 ml/kg，每天1次，直至孕鼠分娩當日為止。給藥期間，每天稱重，根據體重調整給藥量。孕鼠產仔后，單獨一籠哺養同劑量染毒組子代雌性仔鼠。

1.3 血流動力學參數測定 子代雌性大鼠出生后3個月，稱體重，水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，固定后，行氣管切開并給與人工機械通氣，予右頸總動脈并插入充滿肝素0.9%氯化鈉溶液的導管，并外接BL-420s生物機能系統的換能器，觀察波形，將導管順勢推進左心室，待波形穩定，分別記錄心率（heart rate，HR）、左心室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左心室舒張末壓（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、左心室最大上升速率（maximal rise velocity of left ventricular pressure，+dp/dtmax）和左心室最大下降速率（maximal fall velocity of left ventricular pressure，－dp/dtmax）。

1.4 左心室心肌組織形態學觀察 記錄生后3個月的子代雌性大鼠的血流動力學數據后，迅速打開胸腔并取出心臟，取心尖部分放入10%福爾馬林固定、石蠟包埋，連續切片，片厚5 μm，常規 HE染色等，光學顯微鏡下行組織形態學觀察。取左心室心肌組織，迅速投入3%戊二醛固定緩沖液中，預固定5～10 min待柔軟組織稍變硬后，用刀片快速切成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，然后室溫繼續固定2 h，電鏡標本常規脫水、包埋，超薄切片（厚度為50～70 nm），透射電子顯微鏡觀察超微結構。

1.5 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，數據以±s表示，進行成組t檢驗和單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結果

2.1 一般情況 與正常對照組比較，DEHP染毒組仔鼠的一般行為無明顯改變。分別記錄子代雌性大鼠出生（d0）、生后21 d（d21）及生后70 d（d70）的體重，每組10只。與正常對照組比較，DEHP染毒組雌性仔鼠自出生至成年體重的增長明顯，且隨DEHP劑量的增加，體重增長越明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 血流動力學參數比較 3組子代成年SD雌性大鼠的左心室血流動力學各指標數值，見表2，高劑量組的HR、LVEDP明顯高于正常對照組及低劑量組（10 mg/kg），而 LVSP、+dp/dtmax及－dp/dtmax明顯低于正常對照組及低劑量組（10 mg/kg），差異有統計學意義（P＜0.01）。

表1 子代雌性大鼠體重（g，n=10，±s）

表1 子代雌性大鼠體重（g，n=10，±s）

與正常對照組比較:*P＜0.05

時間 正常對照組 低劑量組 高劑量組 F值 P值d 0 6.438 ±0.36 7.003±0.494* 7.008±0.575*4.543 0.020 d 21 54.519 ±2.599 57.290 ±1.947* 59.468 ±3.630* 7.847 0.002 d 70 280.600 ±8.016 287.100±3.212 303.300±10.252*22.814 0.000

表2 左心室功能及血流動力學參數的比較（n=11，±s）

表2 左心室功能及血流動力學參數的比較（n=11，±s）

與正常對照組比較:*P＜0.05

項目 正常對照組 低劑量組 高劑量組 F值 P值HR（次/min） 370.82±13.97 373.45±3.47 407.64±12.38*38.571 0.000 LVSP（kPa） 18.86 ±0.70 19.30 ±0.65 15.04 ±0.37* 173.858 0.000 LVEDP（kPa） 0.89 ±0.22 0.80 ±0.21 2.28 ±0.29* 125.607 0.000+dp/dtmax（kPa）1 074.08 ±78.36 1 012.37 ±74.53 773.29 ±61.98* 53.589 0.000－dp/dtmax（kPa）－892.30±71.18－937.28±90.26－567.02±35.09*93.250 0.000

2.3 左心室心肌組織形態學表現

2.3.1 光鏡 宮內暴露DEHP的子代成年雌性大鼠的心臟病理改變見圖1。正常對照組的雌性大鼠心肌纖維排列整齊，肌漿豐富，核呈現卵圓形，位居中央或一側。宮內暴露不同劑量DEHP的成年雌性大鼠的心臟病變呈不同改變，見圖1A;低劑量（10 mg/kg）DEHP宮內暴露的成年大鼠的心肌細胞基本同正常對照組心肌細胞大小，心肌細胞排列基本整齊，偶見、部分心肌細胞核固縮、深染，見圖1B;高劑量（100 mg/kg）DEHP宮內暴露的成年雌性大鼠心肌細胞肥大，心肌纖維排列紊亂，大量心肌細胞核核固縮、深染，見圖1C。

圖1 宮內暴露DEHP的子代成年雌性大鼠的心臟病理改變 ×100

2.3.2 電鏡 宮內暴露不同劑量DEHP的子代成年雌性大鼠的心肌超微結構改變見圖2。正常對照組子代雌性大鼠心肌細胞核染色質分布均勻，肌原纖維橫紋清晰，心肌纖維排列正常，線粒體嵴排列清楚，見圖2A。宮內暴露不同劑量DEHP的條件下，成年雌性大鼠的心肌細胞超微結構改變程度不同，以高劑量DEHP引起的損傷較重;低劑量組大鼠心肌細胞核形不整（紅色箭頭所示），心肌纖維排列偶見紊亂（黑色箭頭所示），線粒體基質嵴小部分斷裂、模糊，見圖2B;高劑量組大量心肌細胞核固縮、深染（紅色箭頭所示），心肌纖維排列紊亂、斷裂（黑色箭頭所示），線粒體嵴排列大部分斷裂、模糊，見圖2C。

圖2 宮內暴露不同劑量DEHP的子代成年雌性大鼠的心肌超微結構改變

3 討論

DEHP為環境暴露水平最高的一種鄰苯二甲酸酯類化合物，作為塑化劑普遍存在日常生活（食品包裝、化妝品、玩具等）中，目前在醫療領域的應用也越來越廣泛，如血袋、靜脈輸液袋、輸血器、腹膜透析袋、心肺分流術軟管、血液透析管等。尤其是新生兒加強監護病房的患兒可以接觸到醫療設備中高濃度的DEHP。一般人群的DEHP暴露水平估計平均每天3～30 μg/kg體重（不包括職業暴露、各種醫療暴露及兒童非飲食攝入），主要來源于食品中DEHP的殘留［3］。孕婦和發育期兒童對DEHP更為敏感。

Aronson et al［4］研究發現 DEHP 可影響大鼠心臟的電生理變化。2013年第1次發現宮內暴露DEHP可影響子代雄性成年大鼠心血管功能，導致全身動脈收縮壓、舒張壓及活性均降低［5］。但對于雌性大鼠的影響未見報道。

本研究顯示宮內暴露DEHP的雌性仔鼠，其體重增長與DEHP劑量相關，高劑量組（100 mg/kg）子代雌性成年鼠的體重增長明顯，與正常對照組及低劑量組（10 mg/kg）有顯著性差異，其機制可能與DEHP在體內被分解為單脂等價物鄰苯二甲酸單乙基己基酯（MEHP），MEHP激活過氧化物酶體增值物激活受體-γ（PPARγ），從而誘導脂肪形成［6］。普通飲食和含高脂肪的飲食并不會引起動物肥胖［2］。這可能僅僅是由PPARα的肝臟氧化作用導致的，故該試驗中玉米油并不影響實驗結果，可作為正常對照組。宮內暴露DEHP子代雄性大鼠生后體重的增長與正常對照組比較，其結果無顯著差異［7］。Posnack et al［8］認為暴露于 DEHP 的心肌細胞，其代謝元件受到影響，尤其長期脂酸的形成可激起心臟出現缺血損害及心室功能不全。

應用左心室插管測定心臟血流動力學參數，可以直接采集并實時定量分析各種血流動力學參數，與超聲心動圖方法測定心功能比較，更能精準地監測心臟功能學的微小變化。心臟的工作性能主要取決于心室肌的收縮和舒張性能，常以LVSP和+dp/dtmax反映左心室的收縮功能;以LVEDP、－dp/dtmax反映左心室的舒張性能，反映了心室的充盈度、舒張功能及順應性。該研究通過宮內暴露DEHP的子代雌性成年大鼠的血流動力學參數的比較，發現高劑量組的LVSP、+dp/dtmax及－dp/dtmax明顯低于正常對照組及低劑量組（10 mg/kg），LVEDP明顯升高，說明高劑量組心臟的收縮功能及舒張功能均受到影響。DEHP低劑量時，心率略增加，LVSP也是略增加的;而DEHP高劑量組的心率繼續增加時，LVSP反而下降。這也符合心率影響心肌收縮力的變化規律。宮內暴露DEHP的子代成年雌性大鼠的收縮功能減低，可能是DEHP的代謝物MEHP引起與心臟的負性變力效應［9］。Gillum et al［10］也證實了臨床濃度的DEHP可使電耦合的調節能力明顯低下，也是成為心功能顯著損害的可能因素。

另一方面，該研究顯示宮內暴露DEHP的子代雌性大鼠的心肌組織都有不同程度的損害，且以高劑量組的心肌組織損害更為顯著。主要表現為心肌細胞肥大，心肌纖維排列紊亂、斷裂，核固縮、深染，線粒體嵴斷裂、模糊等。這些結果可能是導致左心室順應性減低、心肌收縮的基礎結構受到破壞和心肌細胞能量供應受限的原因，從而減弱心臟舒張和收縮能以及心力儲備，導致心臟血流動力學參數異常。

本研究探討宮內DEHP暴露對子代雌性大鼠的體重及心臟功能的影響，結果顯示宮內DEHP的暴露，不僅可以導致子代雌性出現肥胖癥等癥狀，還存在顯著的心臟血流動力學異常和心肌超微結構的損傷，值得臨床進一步關注。

［1］Kamrin M A.Phthalate risks，phthalate regulation，and public health:a review［J］.J Toxicol Environ Health B Crit Rev，2009，12（2）:157－74.

［2］Schmidt J S，Schaedlich K，Fiandanese N，et al.Effects of di（2-ethylhexyl）phthalate（DEHP）on female fertility and adipogenesis in C3H/N mice［J］.Environ Health Perspect，2012，120（8）:1123－9.

［3］Koch H M，Drexler H，Angerer J.An estimation of the daily intake of di（2-ethylhexyl）phthalate（DEHP）and other phthalates in the general population［J］.Int J Hyg Environ Health，2003，206（2）:77－83.

［4］Aronson C E，Serlick E R，Preti G.Effects of di-2-ethylhexyl phthalate on the isolated perfused rat heart［J］.Toxicol Appl Pharmacol，1978，44（1）:155－69.

［5］Martinez-Arguelles D B，McIntosh M，Rohlicek C V，et al.Maternal in utero exposure to the endocrine disruptor di-（2-ethylhexyl）phthalate affects the blood pressure of adult male offspring［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2013，266（1）:95－100.

［6］Feige J N，Gelman L，Rossi D，et al.The endocrine disruptor monoethyl-hexyl-phthalate is a selective peroxisome proliferatoractivated receptor gamma modulator that promotes adipogenesis［J］.J Biol Chem，2007，282（26）:19152－66.

［7］Vo T T，Jung E M，Dang V H，et al.Differential effects of flutamide and di-（2-ethylhexyl）phthalate on male reproductive organs in a rat model［J］.J Reprod Dev，2009，55（4）:400－11.

［8］Posnack N G，Swift L M，Kay M W，et al.Phthalate exposure changes the metabolic profile of cardiac muscle cells［J］.Environ Health Perspect，2012，120（9）:1243－51.

［9］Rock G，Labow R S，Franklin C，et al.Hypotension and cardiac arrest in rats after infusion of mono（2-ethylhexyl）phthalate（MEHP），a contaminant of stored blood［J］.N Engl J Med，1987，316（19）:1218－9.

［10］Gillum N，Karabekian Z，Swift L M，et al.Clinically relevant concentrations of di（2-ethylhexyl）phthalate（DEHP）uncouple cardiac syncytium［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2009，236（1）:25－38.

Maternal in utero exposure todi-（2-ethylhexyl）phthalate affects the heart of adult female offspring

Zhao Qingsong1，Fang Rui2，Wu De1，et al
（1Dept of Pediatrics，The First Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022;2Dept of Pediatrics，The Second Hospital of Anhui Medical University，Hefei230601）

ObjectiveTo investigate the cardiac effects of DEHP exposure during pregnancy on female rats offspring.MethodsPregnant SD rats were gavaged from gestationa day 0 until birth with corn oil，low ［10 mg/（kg·d）］dose DEHP and high［100 mg/（kg·d）］dose DEHP.Each group consists of two pregnant dams.The outcomes of general morphometry（weight），cardiac histology and cardiac function were studied.Results① When exposed to DEHP during pregnancy，body weight of female rats offspring increased from PND 0（Postnatal day 0）to PND 70.The increase level of weight was significantly higher in high dose group at PND 70（P＜0.05）.②Compared with control group and low dose DEHP group，the heart rate（HR）and left ventricular end-diastolic pressure（LVEDP）of female adult rats were deteriorated in the high dose DEHP group，while left ventricular systolic pressure（LVSP），maximal rise velocity of left ventricular pressure（+dp/dtmax）and maximal fall velocity of left ventricular pressure（－dp/dtmax）of that were significantly decreased（P＜0.05）.③ The cardiac histology effects of high dose DEHP exposure as follows:Pathological observation demonstrated cardiac myocyte hypertrophy，myocardial fiber disarray，a large number of myocardial cells karyopycnosis and stained;electron microscopy showed a lot of myocardial cells karyopycnosis and stained，myocardial fiber disorder and fracture arrangement，most of mitochondrial cristae were broken and blurred.However，no obvious change was found in the control group and low dose DEHP group.ConclusionHigh dose DEHP exposure in utero may lead weight increase，hemodynamic and myocardial abnormalities of female rats offspring.

Di（2-ethylhexyl）phthalate;embryo;myocardial cells;cardiac function

R 725.4

A

1000－1492（2014）05－0618－04

2014－01－05接收

安徽省教育廳自然科學重點項目（編號:KJ2007A096）

1安徽醫科大學第一附屬醫院兒科，合肥 230022

2安徽醫科大學第二附屬醫院兒科，合肥 230601

趙青松，女，碩士研究生;

都鵬飛，男，教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail:dpf.ayfy@163.com