rs1333049多態性與漢族人群多囊卵巢綜合征的相關性研究

張 文，王彬彬，王 晶，陳蓓麗，徐玉萍，曹云霞

rs1333049多態性與漢族人群多囊卵巢綜合征的相關性研究

張 文1，王彬彬2，3，王 晶4，陳蓓麗1，徐玉萍1，曹云霞1

目的 了解單核苷酸多態性位點（SNP）rs1333049與多囊卵巢綜合征（PCOS）的關系。方法 采用以睪酮激素水平配對的患者作為對照者進行研究，對139例PCOS患者及141例對照者進行研究。采用實時熒光PCR TaqMan探針方法對INK4區域反義非編碼 RNA（ANRIL）的一個SNPrs1333049進行基因分型分析。結果 在PCOS患者中，各項生化指標和臨床表現在各基因型之間差異無統計學意義。PCOS患者和對照者間基因型分布和等位基因頻率差異無統計學意義（χ2=1.87，P=0.17;χ2=3.25，P=0.20）。結論 染色體9p21上rs1333049多態性與PCOS高雄激素患者無關。

多囊卵巢綜合征;ANRIL;rs1333049;中國漢族

曹云霞，女，主任醫師，教授，博士生導師，責任作者，E－mail:caoyunxia6@126.com

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是較為常見的內分泌系統紊亂的疾病，在育齡期婦女中發病率為5% ～10%［1－2］。根據美國生殖醫學協會/歐洲社會人類生殖和胚胎學會鹿特丹標準，PCOS的診斷必須至少符合以下條件中的兩個:①稀發排卵或無排卵;② 高雄激素血癥或高雄激素的臨床表現（如多毛、痤瘡等）;③ 超聲提示多囊卵巢［3］。在不同表型的PCOS患者中，雄激素過多都是心血管疾病的風險因素［4］。INK4區域反義非編碼RNA（antisense non coding RNA in the INK4 locus，ANRIL）位于染色體9p21，且因其與心血管疾病發生的可疑作用而得到突顯［5］。有研究［6］提示染色體9p21上某區域內存在有風險的單體型對于歐洲人群的心血管疾病中起到重要作用，其中就包括了rs1333049這一單核苷酸多態性位點。該研究旨在評估染色體9p21上代表性多態性位點rs1333049［7］與中國漢族人群中患有多囊卵巢綜合征的患者之間的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取280名婦女分為兩組:PCOS患者組及對照組。根據美國生殖醫學協會/歐洲社會人類生殖和胚胎學會鹿特丹標準，共識診斷PCOS患者139例。診斷標準如下:①月經稀少;黃體生成素（luteinizing hormone，LH）/卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）≥2;② 高雄激素血癥，血總睪酮（Total testosterone，TT）＞2.8 nmol/L;③ 超聲提示多囊卵巢。對照組141例女性有正常月經周期，正常的FSH、LH、TT生化檢查結果，并且沒有PCOS癥狀或任何其他類型的慢性無排卵疾病。患者來源于在醫院生殖醫學中心就診的不孕癥患者。本研究經醫院倫理委員會批準，并獲得患者知情同意及簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般資料的采集 采用統一的調查問卷，了解研究對象的一般資料和臨床資料，如年齡、月經史、婚育史等。

1.2.2 生化指標的檢測 內分泌激素測定:抽血時間為早卵泡期即月經周期的第5～7天，閉經者無時間限制，取空腹靜脈血用放射免疫法測定雌二醇（estradiol，E2）、孕激素（progesterone，P）、睪酮（testosterone，T）、FSH、LH、血清泌乳素（plasma prolactin，PRL）。

1.2.3 基因型分析 基因序列信息來自Hapmap數據庫。實時定量熒光PCR反應體系為10 μl，基因組 DNA 1μl，5 μl 2 × TaqMan Universal PCR Master Mix，3.5 μl雙蒸水和0.5 μl 20 ×Assay Mix。反應條件為:60℃ 30 s，95℃預變性10 min，95℃ 10 s，60℃ 1 min，共40個循環。基因分型分為 GG、CG、CC型。檢測儀器為StepOne PCR real time Sys－tem（美國ABI公司），分析軟件為SDS software 2.0（美國ABI公司）。每個檢測單元均設立陰性對照。

1.3 統計學處理 應用SPSS 10.0軟件進行統計分析，PCOS患者組和對照組間基因型和等位基因頻率差異（計量資料）比較運用χ2檢驗，PCOS患者組和對照組臨床資料間（組間）差異運用t檢驗。

2 結果

2.1 一般資料 PCOS患者組和對照組FSH和LH水平比較差異有統計學意義（P＜0.05）。PCOS患者組與對照組比較更具有發生心血管疾病風險因子，如 T水平和身體質量指數（body mass index，BMI）值（P＜0.05）。見表1。

表1 PCOS患者組與對照組臨床資料比較（±s）

表1 PCOS患者組與對照組臨床資料比較（±s）

項目 患者（n=139） 對照（n=141） P值年齡（歲） 25.73±3.8（17～35）29.79±3.6（23～40）＜0.01初潮年齡（歲） 15.0±2.2 14.49±1.3 0.23 BMI 23.00±5.0 21.66±2.9 ＜0.01身高 （cm） 160.0±4.9 160.23±5.2 0.15體重 （kg） 60.3±13.0 55.55±7.5 ＜0.01 E2（pmol/L） 257.99±173.1 156.05±75.9 ＜0.01 FSH（IU/L） 3.97±1.2 6.90±1.4 ＜0.01 LH（IU/L） 11.26±3.26 5.56±2.20 ＜0.01 PRL（ng/ml） 79.45±53.5 21.69±27.7 0.17 T（nmol/L）3.47±0.8 1.08±0.6 ＜0.01

2.2 基因型分析

2.2.1 TaqMan探針基因分型圖 結果見圖1。

圖1 rs1333049位點3種基因型的TaqMan探針結果

2.2.2 基因型及等位基因頻率 PCOS患者組與對照組間基因型分布和等位基因頻率差異無統計學意義（χ2=1.87，P=0.17;χ2=3.25，P=0.20）。見表2。

3 討論

PCOS不僅是一個生殖障礙疾病，同時也是一種可能長期影響婦女健康的代謝性疾病。根據鹿特丹標準PCOS表型得到擴展，包括有高雄激素表現的正常月經周期婦女和無雄激素過高的月經周期不規律的婦女。最近根據鹿特丹標準評估不同PCOS表型的內分泌指標，有高雄激素血癥表現的所有表型都有腰圍增加和胰島素抵抗，而有多囊卵巢形態的無排卵非高雄激素血癥的患者與對照比較卻無此趨勢。這就帶來一個新的問題，這些新的PCOS表型是否存在代謝紊亂，甚至增加罹患糖尿病或心血管疾病的風險。同時，循環內的內源性雄激素在代謝改變，以及PCOS患者和健康女性體內的心血管系統中的作用仍不清楚。在部分同樣的樣本中檢測出過早動脈粥樣硬化升高的血清標志物，如C反應蛋白和同型半胱氨酸以及內皮功能障礙。PCOS患者是早發心血管疾病高風險的最大群體［8］。近期文獻［9］報道有增厚的頸動脈內膜厚度（intima－media thickness，IMT）的 PCOS患者相較于健康對照者而言動脈粥樣硬化傾向性明顯增加，而IMT可通過無創檢查對潛在的血管疾病進行評價。基于已知的心血管代謝的風險因子，PCOS患者心血管疾病的風險較正常女性高出5～7倍［10］。

表2 PCOS患者組和對照組中rs1333049（C/G）基因型和等位基因頻率［n（%）］

染色體9p21上這個區域含有編碼2個細胞周期依賴激酶抑制因子—CDKN2A和CDKN2B基因的編碼序列。這兩個基因在細胞周期調節中起重要作用，并且可能通過其在轉化生長因子（TGF）－β誘導生長抑制中的作用參與到動脈粥樣硬化的病理過程中［11－12］。有報道［13］稱染色體 9p21 上 ANRIL 參與到CDKN2B－p16/CDKN2Ap14細胞周期基因簇的調節。rs1333049多態性是與疾病相關因子中聯系最強的。有前期研究［7］證實rs1333049與多種心血管疾病之間存在相關性。然而，在PCOS患者組與對照組間rs1333049位點基因型分布與等位基因頻率并無顯著性差異;致使無法確定兩者之間的聯系。在心血管疾病病理發生過程中有多種風險因子參與，而在實驗中PCOS患者的高T水平并不是心血管疾病發生的唯一病因。本研究收集病例均來自生育年齡婦女，而心血管疾病的發展則需要長時間的過程，這有可能是另一個導致實驗無法在PCOS和心血管疾病間建立聯系的原因。盡管絕經后卵巢不能芳香化，但依然可以持續產生雄激素，所以絕經效應在循環內雄激素水平改變上并不是很明顯。高雄激素血癥在中年持續的程度可能決定有PCOS病史的老年婦女罹患心血管疾病的風險程度。

本研究是首次觀察rs1333049在有高雄激素血癥的PCOS患者身上發揮的作用。結果顯示rs1333049多態性位點可能與中國漢族人群中PCOS患者無明顯相關性。需要其他大樣本例數的實驗，以求進行更深入的研究，更真實地反映群體的情況。

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An association study of rs1333049 polymorphism with polycystic ovarian syndrome in Chinese Han population

Zhang Wen1，Wang Binbin2，3，Wang Jing4，et al
（1Dept of Reproductive Medicine Center，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022;2Center for Genetics，National Research Institute for Family Planning，Beijing100081;3Peking Union Medical
College，Beijing100730;4Dept of Medical Genetics，Capital Medical University，Beijing100069）

ObjectiveTo investigate the association between rs1333049 polymorphism and the risk of polycystic ovarian syndrome（PCOS）in Chinese population.Methods139 PCOS patients and 141 healthy control were divided in two groups by the level of testosterone.The TaqMan real time PCR technique was used to detect the genotypes of a single nucleotide polymorphism rs1333049 in ANRIL from the samples.ResultsIn PCOS women，no significant differences in endocrine clinical and biochemical variables were found between the genotypes.There was no significant difference in genotype distributions and allele frequencies for rs1333049 between PCOS patients and controls.（χ2=1.87，P=0.17;χ2=3.25，P=0.20）.ConclusionThis study demonstrates no association of rs1333049 polymorphism locus on chromosome 9p21 with the risk for PCOS in Han Chinese.

polycystic ovarian syndrome;ANRIL;rs1333049;Chinese Han population

R 588.6

A

1000－1492（2014）05－0622－03

2013－12－10接收

國家“973”項目（編號:2012CB944704）;高等學校博士學科點專項科研基金（編號:20093420110001）

1安徽醫科大學第一附屬醫院婦產科生殖中心，合肥230022

2國家人口計生委科研所遺傳室，北京 100081

3中國協和醫科大學，北京 100730

4首都醫科大學醫學遺傳室，北京 100069

張 文，女，碩士研究生;