干擾睪丸Clock基因對小鼠體外受精的影響

王譽雅+程方巖　成麗琴

【摘 要】目的：研究雄鼠睪丸Clock基因沉默后，小鼠體外受精的變化及機制。方法：通過在ICR小鼠睪丸內注射Clock干擾質粒（實驗組）和HK陰性對照質粒（對照組），注射18天后收集雄鼠精子，計數精子濃度，前向運動精子百分率和精子總活率。再將孵育好的精子加入卵培養皿中，分別觀察卵丘顆粒細胞驅散情況及卵裂情況，計算受精率、囊胚生成百分率和胚胎孵化率。結果：睪丸Clock基因沉默后，小鼠精子活動率及前向運動率較對照組降低（p<0.05），實驗組精子驅散卵丘顆粒細胞能力的時間延長（p<0.001）。結論：睪丸clock基因可影響精子驅散卵丘顆粒細胞的能力，該機制在Clock基因影響小鼠生殖的過程中的作用有待進一步研究。

【關鍵詞】Clock基因；精子；體外受精；前向運動；受精率

0 引言

近日節律在生物的生殖和發育過程中發揮重要作用[1]。Clock基因是近日節律系統的核心成分，它在哺乳動物的生殖器官有表達，如子宮[2]，輸卵管[3]和睪丸[4]等。研究發現Clock基因突變可引起動物生殖能力變化，如L.M.Beaver等發現果蠅睪丸和精囊中的精子數量下降，雄性生育能力降低[5]。通過前期研究，我們發現干擾睪丸Clock基因的表達引起小鼠胎仔數下降[6]，小鼠的生殖能力降低[7]。但Clock基因引起其生殖能力下降這一現象的機制一直未明了，本研究通過向小鼠睪丸注射Clock干擾質粒沉默Clock基因，觀察精子運動和體外受精的變化，以進一步探究Clock基因影響小鼠生殖的機制[8]。

1 材料和試劑

1.1 實驗動物

實驗中雄性ICR小鼠8-10周，雌性ICR小鼠4-6周，均飼養于光暗各12h的循環箱內，自由進食和飲水；將雄性小鼠20只隨機分為實驗組和對照組2組，每組10只，實驗組在睪丸內注射Clock干擾質粒，對照組在睪丸內注射HK陰性質粒。雌鼠10只，每組5只（雌雄比，雌：雄=1：2）。雌雄分開飼養。

1.2 試劑

質粒：Clock干擾質粒（武漢晶賽公司）；HK陰性對照質粒（武漢晶賽公司）；OMEGA質粒提取試劑盒；孕馬血清促性腺激素（PMSG）；絨毛膜促性腺激素（HCG）；HTF培養液；HEPES-HTF培養液；卵裂培養液；囊胚培養液；血清蛋白代用品（SPS）；動物體內轉染試劑In vivo-jetPEITM（Poly Plus）。

2 實驗設計

2.1 實驗處理

雄性小鼠乙醚麻醉。實驗組：用微量注射器將20μlClock干擾質粒注射入小鼠的雙側睪丸里。對照組：用微量注射器將20μlHK陰性對照質粒注射入小鼠的雙側睪丸里。注射質粒18天后，手術法收集精子并孵育精子。向雌鼠體內腹腔注射PMSG 10IU/只，同等條件下培養觀察兩天之后，再次向雌鼠體內腹腔注射HCG 10IU/只，培養并觀察15-16h，用頸脫臼法處死小鼠。配置卵培養液待用。再將孵育好的精子濃度約為1×106/ml精子加入卵培養皿中進行體外受精及胚胎發育的觀察。

2.2 結果觀察

我們在注射質粒后的18天，將收集到雄鼠精子統計分析并計算其精子濃度。精子因為運動方式的不同，可分為三個等級：前向運動（A級：快速前向直線運動和B級：直線運動）、非前向運動（C級：曲線運動和D級：原地打轉）、不動。針對不同視野的200個精子按照運動方式進行分級，計算前向運動精子百分率和精子活動率，以此來觀察和分析精子的活動度的變化。前向運動精子百分率=前向運動精子數/200×100%；精子活動率=（前向運動精子數+非前向運動精子數）/200×100%。

通過計算受精率、囊胚形成率和胚胎孵化率來觀察ICR小鼠體外受精及胚胎發育的情況。按如下方法進行計算：受精率=卵裂胚數/卵丘-卵母細胞復合體數×100%；囊胚形成率=囊胚數/卵裂胚數×100%；胚胎孵化率=孵出胚胎數/囊胚總數×100%。

2.3 統計分析

實驗數據以平均值±標準差（x±s）表示，組間均數的比較用t檢驗，率的比較采用Χ2檢驗。本研究數據均采用SPSS12.0統計軟件進行分析。

3 實驗結果

3.1 精子活動度

實驗結果如表1，實驗組和對照組的精子濃度分別為（16.77±7.65）×106/ml、（18.76±10.37）×106/ml，兩組精子濃度無明顯差異（P>0.05）。

表1 干擾小鼠睪丸Clock基因后精子的活動度

注：*與對照組相比，p<0.05.

實驗組前向運動精子百分率為（36.09±7.54）%，精子活動率為（62.83±8.20）%；對照組前向運動精子百分率為（42.00±8.02）%，精子活動率為（69.44±9.47）%，兩組差異均有統計學意義（p<0.05），實驗組前向運動精子百分率、精子活動率下降。

3.2 體外受精及早期胚胎發育

觀察獲能精子與成熟卵母細胞共孵育情況發現，與實驗組精子共孵育的卵母細胞外卵丘顆粒細胞被驅散速度明顯延遲。在共孵育5分鐘時，對照組中所有卵母細胞外卵丘顆粒細胞均被驅散，而實驗組中所有卵母細胞外卵丘顆粒細胞并未被驅散（表2）。

表2 體外受精后卵母細胞外卵丘顆粒細胞驅散情況

*：Χ2檢驗，p<0.001.

體外受精后形成的2-細胞胚胎，4-細胞胚胎。實驗組的受精率為（63.66±12.60）%，對照組的受精率為（78.83±14.38）%，差異有統計學意義（p<0.05），表明Clock基因沉默后，受精率降低。受精后第3天更換新的囊胚培養液培養至受精后第6天，觀察記錄囊胚的形成和孵化情況。統計結果表明，受精后，實驗組囊胚的形成率、孵化率和對照組相比，均無明顯差異。

表3 干擾小鼠睪丸Clock基因后其精子體外受精及

早期胚胎發育的情況

注：*與對照組相比，p<0.05

4 討論

Clock基因是近日節律的核心基因，在CLOCK蛋白與Bmal1形成的異二聚體中發揮重要作用。我們用RNAi干擾CLOCK蛋白的表達，發現小鼠的生殖能力明顯受到影響。本文進一步觀察Clock基因干擾后，雄鼠精子運動能力和授精能力的變化。

精子運動能力的強弱與受精密切相關，只有正常（下轉第87頁）（上接第8頁）前向運動的精子才可能抵達輸卵管壺腹部與卵子結合形成受精卵。本研究發現Clock基因沉默后，精子前向運動的百分率降低，在體外受精過程中，精子驅散顆粒細胞能力有所降低，提示實驗組很可能影響了精子頂體反應的酶，使得其受精率降低。在精子形成過程中，發育中的頂體發現有Clock基因的表達，用RNAi干擾Clock基因的表達，小鼠睪丸CLOCK蛋白的表達明顯下調，頂體酶活性明顯降低。綜合上述研究和本研究的結果，可以推測Clock基因通過影響頂體酶的活性，進一步影響精子驅散卵丘顆粒細胞的能力。體外受精成功后，早期胚胎形成發育過程中，囊胚的形成率和胚胎的孵化率無統計學意義，但胎仔數卻明顯下降。因此，睪丸Clock基因干擾可引起精子前向運動異常和驅散卵丘時間延長，影響了雄性小鼠的生殖功能，但其具體機制以及對胚胎發育的影響尚需進一步的研究。

【參考文獻】

[1]王凌，崔允文.國外時間生物學進展[J].生物醫學工程學雜志，2005，1：185.

[2]Johnson M H， Lim A， Fernando D， et al. Circadian clockwork genes are expressed in the reproductive tract and conceptus of the early pregnant mouse[J]. Reproductive biomedicine online，2002，4（2）：140-145.

[3]Kennaway D J， Varcoe T J， Mau V J. Rhythmic expression of clock and clock‐controlled genes in the rat oviduct[J]. Molecular human reproduction， 2003，9（9）：503-507.

[4]Alvarez J D， Chen D， Storer E， et al. Non-cyclic and developmental stage-specific expression of circadian clock proteins during murine spermatogenesis[J]. Biology of reproduction， 2003，69（1）：81-91.

[5]Beaver L M， Gvakharia B O， Vollintine T S， et al. Loss of circadian clock function decreases reproductive fitness in males of Drosophila melanogaster[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2002，99（4）：2134-2139.

[6]蔣小輝，葉珊，汪宇輝，等.近日節律基因 Clock 對雄性小鼠生殖功能的影響[J].航天醫學與醫學工程，2007，20（5）：354-357.

[7]Low-Zeddies S S， Takahashi J S. Chimera Analysis of the< i> Clock Mutation in Mice Shows that Complex Cellular Integration Determines Circadian Behavior[J]. Cell， 2001，105（1）：25-42.

[8]蔣小輝，劉延友，葉珊，等.節律基因 Clock 對雄性小鼠頂體酶活性的影響[J].西部醫學，2007，19（3）：339-341.

[責任編輯：湯靜]

表3 干擾小鼠睪丸Clock基因后其精子體外受精及

早期胚胎發育的情況

注：*與對照組相比，p<0.05

4 討論

Clock基因是近日節律的核心基因，在CLOCK蛋白與Bmal1形成的異二聚體中發揮重要作用。我們用RNAi干擾CLOCK蛋白的表達，發現小鼠的生殖能力明顯受到影響。本文進一步觀察Clock基因干擾后，雄鼠精子運動能力和授精能力的變化。

精子運動能力的強弱與受精密切相關，只有正常（下轉第87頁）（上接第8頁）前向運動的精子才可能抵達輸卵管壺腹部與卵子結合形成受精卵。本研究發現Clock基因沉默后，精子前向運動的百分率降低，在體外受精過程中，精子驅散顆粒細胞能力有所降低，提示實驗組很可能影響了精子頂體反應的酶，使得其受精率降低。在精子形成過程中，發育中的頂體發現有Clock基因的表達，用RNAi干擾Clock基因的表達，小鼠睪丸CLOCK蛋白的表達明顯下調，頂體酶活性明顯降低。綜合上述研究和本研究的結果，可以推測Clock基因通過影響頂體酶的活性，進一步影響精子驅散卵丘顆粒細胞的能力。體外受精成功后，早期胚胎形成發育過程中，囊胚的形成率和胚胎的孵化率無統計學意義，但胎仔數卻明顯下降。因此，睪丸Clock基因干擾可引起精子前向運動異常和驅散卵丘時間延長，影響了雄性小鼠的生殖功能，但其具體機制以及對胚胎發育的影響尚需進一步的研究。

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[6]蔣小輝，葉珊，汪宇輝，等.近日節律基因 Clock 對雄性小鼠生殖功能的影響[J].航天醫學與醫學工程，2007，20（5）：354-357.

[7]Low-Zeddies S S， Takahashi J S. Chimera Analysis of the< i> Clock Mutation in Mice Shows that Complex Cellular Integration Determines Circadian Behavior[J]. Cell， 2001，105（1）：25-42.

[8]蔣小輝，劉延友，葉珊，等.節律基因 Clock 對雄性小鼠頂體酶活性的影響[J].西部醫學，2007，19（3）：339-341.

[責任編輯：湯靜]

表3 干擾小鼠睪丸Clock基因后其精子體外受精及

早期胚胎發育的情況

注：*與對照組相比，p<0.05

4 討論

Clock基因是近日節律的核心基因，在CLOCK蛋白與Bmal1形成的異二聚體中發揮重要作用。我們用RNAi干擾CLOCK蛋白的表達，發現小鼠的生殖能力明顯受到影響。本文進一步觀察Clock基因干擾后，雄鼠精子運動能力和授精能力的變化。

精子運動能力的強弱與受精密切相關，只有正常（下轉第87頁）（上接第8頁）前向運動的精子才可能抵達輸卵管壺腹部與卵子結合形成受精卵。本研究發現Clock基因沉默后，精子前向運動的百分率降低，在體外受精過程中，精子驅散顆粒細胞能力有所降低，提示實驗組很可能影響了精子頂體反應的酶，使得其受精率降低。在精子形成過程中，發育中的頂體發現有Clock基因的表達，用RNAi干擾Clock基因的表達，小鼠睪丸CLOCK蛋白的表達明顯下調，頂體酶活性明顯降低。綜合上述研究和本研究的結果，可以推測Clock基因通過影響頂體酶的活性，進一步影響精子驅散卵丘顆粒細胞的能力。體外受精成功后，早期胚胎形成發育過程中，囊胚的形成率和胚胎的孵化率無統計學意義，但胎仔數卻明顯下降。因此，睪丸Clock基因干擾可引起精子前向運動異常和驅散卵丘時間延長，影響了雄性小鼠的生殖功能，但其具體機制以及對胚胎發育的影響尚需進一步的研究。

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[5]Beaver L M， Gvakharia B O， Vollintine T S， et al. Loss of circadian clock function decreases reproductive fitness in males of Drosophila melanogaster[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2002，99（4）：2134-2139.

[6]蔣小輝，葉珊，汪宇輝，等.近日節律基因 Clock 對雄性小鼠生殖功能的影響[J].航天醫學與醫學工程，2007，20（5）：354-357.

[7]Low-Zeddies S S， Takahashi J S. Chimera Analysis of the< i> Clock Mutation in Mice Shows that Complex Cellular Integration Determines Circadian Behavior[J]. Cell， 2001，105（1）：25-42.

[8]蔣小輝，劉延友，葉珊，等.節律基因 Clock 對雄性小鼠頂體酶活性的影響[J].西部醫學，2007，19（3）：339-341.

[責任編輯：湯靜]