PPARγ、PTEN、Akt在胃癌中的表達及其與胃癌生物學行為的關系

廖山嬰 朱小波 王蓓蓓 馬娟 沙衛紅

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，近年來胃癌患病率有逐年上升趨勢，且發病日益年輕化，嚴重影響人民健康，目前胃癌的病因和發病機制尚未完全闡明[1］。近年來過氧化物酶增殖激活受體γ（PPARγ）與腫瘤關系的研究受到廣泛關注，許多惡性腫瘤中存在PPARγ的異常表達，PPARγ被配體激活后可抑制腫瘤生長[2-3］。我們前期研究發現，PPARγ配體羅格列酮具有預防化學致癌劑N-甲基-N'-硝基-亞硝基胍誘導大鼠腺胃癌發生的作用[4］。PPARγ2 Pro12Ala基因多態性與我國漢族人群胃癌的發生有關，增加幽門螺桿菌（Hp）感染后胃癌發生的危險性[5］。以上結果表明PPARγ與胃癌發生、發展密切相關，然而PPARγ在體內的研究還鮮有報道。本研究采用逆轉錄PCR法（RTPCR）檢測胃癌組織中PPARγ及10號染色體缺失張力蛋白同源的磷酸酶基因（PTEN）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）mRNA的表達，并結合胃癌患者的臨床病理特征，分析三者的關系及其與胃癌生物學行為的相關性。

材料與方法

一、材 料

選取2010年10月至2012年10月我院胃腸外科行胃癌根治術并均經術后病理檢查證實為胃癌標本60例，相應的癌旁正常組織（距腫瘤邊緣≥5 cm，手術后證實殘端無癌殘留）60例，組織取材后立即放入液氮凍存備用。所有患者術前均未予放射化學治療。其中男38例，女22例；年齡33～72歲，中位年齡53歲；高、中分化腺癌36例，低分化腺癌24例；臨床分期采用國際抗癌聯盟（UICC）胃癌TNM 分期方法，其中Ⅰ+Ⅱ期28例，Ⅲ+Ⅳ期32例；淋巴結轉移41例，無淋巴結轉移19例；遠處轉移13例，無遠處轉移47例；腫瘤浸潤未侵及漿膜層者26例，浸潤超過漿膜層者34例。另取本院同期胃鏡室的鏡下活檢20名正常胃黏膜標本（胃鏡標本）作為正常對照。所有取材患者均知情同意。

二、研究方法

1.主要試劑

RNA抽提試劑盒購自上海生物工程技術服務有限公司；Trizol RNA提取液、RNA酶抑制劑、AMV逆轉錄酶和DNA Ladder Marker購自Invitrogen；EDTA、DEPC購自Sigma；Taq DNA聚合酶、dNTP購自Promega；電泳儀和凝膠成像掃描分析儀購自美國Bio Rad；PCR擴增儀9600購自美國PE公司；紫外分光光度計DU70購自美國Beckman公司；臺式低溫高速離心機購自Eppendorf。引物設計參照Genebank資料，由計算機軟件設計，中山大學達安基因生物技術有限公司合成，擴增用引物見表1。

2.方 法

2.1 總RNA的提取和cDNA合成 按照RNA提取試劑盒說明書提取3組標本組織總RNA，RNA純度OD260/OD280在1.8～2.0。用AMV逆轉錄酶進行cDNA合成，-20℃保存。

2.2 RT-PCR擴增 PCR反應體系組成：cDNA模板1μl，5×PCR buffer 5μl，上游引物1μl，Taq酶2.5 ul，10mM dNTPs 1μl，加去離子水補至20μl。反應條件：95℃熱啟動15 min，93℃預變性3 min，93℃變性45 s，55℃退火60 s，72℃延伸60 s，共30個循環，最后72℃充分延伸10 min。完畢后取擴增產物5μl，加6×上樣緩沖液2μl，用1.5%瓊脂凝膠在82伏特的電壓下電泳30 min。

2.3 結果判定 結果進行凝膠圖像吸光度分析，掃描定量分析DNA帶的含量，以所測得的積分吸光度與內參照β-actin積分吸光度的比值代表半定量值。實驗重復3次，取其平均值進行統計分析。比較腫瘤組織、瘤旁組織及正常組織中表達差異。

三、統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件包進行統計學分析。計量資料用以表示，多組樣本均數比較采用單因素方差分析（ANOVA），PPARγ、PTEN、Akt mRNA的表達與胃癌臨床病理特征的關系用檢驗獨立樣本t檢驗，相關性采用Spearman相關分析。

結 果

一、PPARγ、PTEN、Akt mRNA在胃癌組織、癌旁組織及正常胃組織中的表達

PPARγ、PTEN及Akt mRNA經RT-PCR擴增后，擴增產物長度分別是163 bp、280 bp和217 bp，內參β-actin的擴增產物為418 bp，見圖1。胃癌組織中PPARγ及Akt mRNA表達水平高于癌旁組織及正常胃組織（P＜0.05），而PTEN mRNA表達水平明顯較癌旁組織及正常胃組織低（P＜0.05），在癌旁組織與正常胃組織間PPARγ、PTEN、Akt mRNA的表達水平均無明顯差異（P＞0.05），見表2。

圖1 胃癌組織、癌旁組織及正常胃組織PPARγ、PTEN、Akt mRNA表達（RT-PCR）

表2 胃癌組織、癌旁組織及正常胃組織中PPARγ、PTEN、Akt mRNA的表達

表2 胃癌組織、癌旁組織及正常胃組織中PPARγ、PTEN、Akt mRNA的表達

注：與正常胃組織比較，a P＜0.05，F PPARγmRNA=59.029，F PTEN mRNA=24.127，F Akt mRNA=33.173；與癌旁組織比較，b P＜0.05，F PPARγmRNA=36.679，F PTEN mRNA=14.036，F Akt mRNA=9.251；與正常胃組織比較，c P＞0.05，F PPARγmRNA =1.345，F PTEN mRNA=2.798，F Akt mRNA=0.426

組 別 PPARγ mRNA PTEN mRNA Akt mRNA正常胃組織0.58±0.15 1.03±0.25 0.42±0.16癌旁組織 0.72±0.13c 0.87±0.17c 0.50±0.18c胃癌組織 1.51±0.35ab 0.46±0.14ab 1.03±0.31 ab

二、胃癌組織中PPARγ、PTEN、Akt mRNA表達與臨床病理因素的關系

胃癌組織中PPARγ、PTEN、Akt mRNA表達量與患者性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無相關性（P＞0.05），而與胃癌的TNM 分期、侵犯漿膜、淋巴結轉移及遠處轉移相關（P＜0.05），見表3。

三、胃癌組織中PPARγ、PTEN、Akt mRNA表達的相互關系

經Spearman等級相關分析表明，PPARγmRNA與PTEN mRNA表達呈負相關（rs=-0.492，P＜0.05），與Akt mRNA表達呈正相關 （rs=0.623，P＜0.05），PTEN mRNA與Akt mRNA表達呈負相關（rs=-0.565，P＜0.05）。

表3 胃癌組織中PPARγ、PTEN、Akt mRNA的表達與臨床病理因素的關系

續表

討 論

胃癌的發生可能與遺傳、環境及飲食等多種因素有關，現有治療方法如手術、放射治療、化學治療效果均不理想，根除Hp及抗氧化劑治療是否對降低或預防胃癌的發生具有真正價值還在進一步探討[6］。因此胃癌的發病機制和早期預防一直是消化道腫瘤研究熱點。

PPARγ是Ⅱ型核激素受體超家族成員，廣泛分布于全身許多組織如腎臟、肝臟、胃腸道、胰腺、乳腺、脾臟等，在內皮細胞、血管平滑肌細胞和腫瘤細胞亦有表達。在被配體激活后，與類維生素A類受體結合形成異二聚體，再與靶基因啟動子區的特異性DNA序列稱為過氧化體增殖反應元件結合，調控靶基因的轉錄，其生物學效應包括調控脂肪代謝和糖代謝，參與能量儲存和利用，控制單核細胞激活及誘導巨噬細胞凋亡、抗炎癥反應功能及抗動脈粥樣硬化等作用[7］。

近年來研究發現PPARγ與多種消化道腫瘤的發生有關[2-3］。我們的前期動物實驗證明，PPARγ配體羅格列酮能顯著降低化學致癌劑N-甲基-N'-硝基-亞硝基胍誘導的大鼠腺胃癌發生率[4］。同時體內研究顯示，PPARγ2外顯子B第12密碼子的CCA-GCA的錯義突變所致的Pro12Ala基因多態性與我國漢族人群胃癌的發生有關，增加Hp感染后胃癌發生的危險性[5］。為進一步了解PPARγ與胃癌之間的關系，我們檢測了胃癌患者的PPARγ mRNA表達情況，結果顯示，與正常胃組織及癌旁組織相比，胃癌組織中PPARγ呈高表達，與李強等[8］的研究結果一致，進一步證實PPARγ與胃癌的發生發展相關。

PPARγ與腫瘤發生相關業已明確，但其中的作用機制尚不清楚。目前的研究熱點主要集中在PPARγ配體抗腫瘤作用方面，認為其可抑制腫瘤細胞增殖，促進分化并誘導凋亡，抑制血管生成[9］。然而也有研究認為PPARγ配體抗腫瘤作用并不是通過PPARγ途徑起作用的[10］。

PTEN-磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt信號轉導通路是關鍵的細胞增殖相關信號通道之一。抑癌基因PTEN通過第二信使PI3K抑制Akt磷酸化活化，促進細胞色素C從線粒體的釋放及Caspases-9和Caspase-3的激活，從而抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，因此，PTEN-PI3K-Akt信號轉導通路的活性與多種惡性腫瘤的發生、發展密切相關[11］。薛鵬等[12］的研究結果顯示，胃癌組織中PTEN和磷酸化AKT蛋白的陽性表達率均高于相應癌旁組織。近年來研究表明，PPARγ與PTEN-PI3K-Akt信號軸之間也存在聯系，PPARγ配體可通過上調PTEN表達，抑制PI3K/Akt信號軸，從而起到抑制細胞增殖，促進細胞凋亡等抗炎癥、抗腫瘤作用[13-14］。因此，本研究中我們檢測了PPARγ及PTEN、Akt在胃癌患者及正常人群體內表達情況，結果表明，與正常胃組織及癌旁組織相比，胃癌組織中PPARγ及Akt mRNA水平明顯升高，而PTEN表達水平相應下降，三者之間存在相關性。進一步結合胃癌患者的臨床病理特征分析，結果顯示，胃癌組織中PPARγ、PTEN、Akt mRNA表達量與患者性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無相關性，而與胃癌的TNM分期、侵犯漿膜、淋巴結轉移及遠處轉移相關。

PTEN-PI3K-Akt信號轉導通路又是如何參與腫瘤的發生、發展？新近研究表明，Akt可通過下游調控因子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）這一信號通路，調控缺氧誘導因子-1（HIF-1）的活性，促進血管內皮生長因子（VEGF）的表達，進而促進腫瘤發展和新生血管形成[15］。目前我們正在檢測胃癌患者腫瘤組織中的p-mTOR、HIF-1和VEGF的表達，從而進一步探討PTEN-PI3K-Akt/mTOR信號轉導通路在胃癌發病機制中的作用。

綜上所述，PPARγ、Akt的高表達及PTEN低表達與胃癌的生物學行為密切相關，并且三者相互關聯。聯合檢測PPARγ、PTEN、Akt，可能有助于對胃癌惡性程度的判定及侵襲轉移能力的評估，進而為胃癌的預后分析和進一步治療提供參考依據和新的靶點。

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