不同濃度6-BA對黑麥草種子出愈率的影響

文沛玲，瞿 楊， 葉光明，楊秉健，杜小姣

(1.深圳日昇園林綠化有限公司，廣東 深圳 518040； 2.北京林業大學 草坪研究所，北京 100083)

多年生黑麥草(Loliumperenne)屬冷季型禾草，由于其為異花風媒傳粉禾本科植物，高度自交不親和，優良基因難以純合穩定下來，這使其遺傳改良困難而復雜，用傳統的方法育種，耗時費力，困難大，難以取得突破性進展。因此，組織培養和遺傳轉化技術的發展為多年生黑麥草的遺傳改良開辟了一條新途徑。1975年，Dale[1]首先通過莖尖分生組織培養獲得了可育的多年生黑麥草再生植株。Spangenberg等[2]首先用基因槍轉化法得到黑麥草轉基因植株。近年來，有利用基因工程培育和改良黑麥草品種的研究報道，且愈傷組織可以作為基因槍法和農桿菌介導轉化法的受體，因此，對愈傷組織培養的研究是十分必要的[3]，獲得高質量的愈傷組織才能夠為進一步的誘導分化和生根提供物質前提[4]。

目前，國內以黑麥草成熟種子為外植體的研究中，曾升堅等[5]得出，在MS培養基中附加8 000 mg/L的2,4-D和0.025 mg/L的6-BA時誘導率最高。而徐定炎等[6]認為，黑麥草成熟種子愈傷組織誘導率最高時6-BA 濃度為0 mg/L；吳蓮蓉等[7]篩選出黑麥草成熟種子愈傷組織誘導的最佳組合為：0.05 mg/L的6-BA濃度+黑麥草品種特高+CC基本培養基。楊茹等[8]通過試驗認為，2,4-D濃度在7 mg/L、6-BA濃度為0.1 mg/L時有利于多年生黑麥草成熟種子誘導產生愈傷組織；杜雪玲等[9]通過試驗表明，2,4-D為5 mg/L，6-BA為0.05 mg/L時，黑麥草各品種愈傷組織的質量和誘導率最高；代亮等[10-12]的研究表明，基因型的差異會導致品種對6-BA的敏感度不同，在愈傷組織培養時需要謹慎使用6-BA。多年生黑麥草組織培養條件的影響因素依然是一個亟待研究的重要課題。因此，選取不同品種的多年生黑麥草成熟種子為外植體，研究不同濃度6-BA 對多年生黑麥草愈傷組織誘導的影響，并試圖找到6-BA 最佳濃度及能產生高出愈率的黑麥草基因型(品種)，為多年生黑麥草組織培養及遺傳轉化打下基礎，培育和篩選出我國草業生產所需的抗逆性強的優質多年生黑麥草草種。

1 材料和方法

1.1 供試材料

選取夜影(Evening shade,E)、蒙特利Ⅲ(MontereyⅢ,M)、高帽(Top hat,T)和德比極品(Derby Xtreme,Dx)4個抗性良好的多年生黑麥草品種。

1.2 外植體的消毒與接種

將適量的各個品種的多年生黑麥草種子置于離心管中，加入次氯酸鈉溶液(活性氯7%，約50 mL)和2滴Tween-20，振蕩消毒40～50 min，然后用無菌蒸餾水清洗6次以上[13]。放置于4 ℃冰箱2～3 d。再次用無菌蒸餾水清洗3次，濾紙濾干水分后直接接種。

1.3 培養基的配置

以MS基本培養基為基礎，加入3 g/L植物凝膠或8 g/L瓊脂，30 g/L蔗糖，調節pH至6.0，高壓滅菌15 min(121 ℃)，觀察其他因素對愈傷組織誘導的影響。

MS基本培養基：MS大量元素+MS微量元素+MS鐵鹽+MS有機成分。

愈傷組織誘導培養基：MS基本培養基+6-BA+4.0 mg/L 2,4-D+0.1 g/L水解酪蛋白(AHC)+0.1 g/L肌醇+蔗糖30 g/L+8 g/L瓊脂。

6-BA濃度梯度為0、0.1、0.2、0.3和0.5 mg/L。

1.4 愈傷組織誘導

將經過消毒處理的4個多年生黑麥草品種的種子，在無菌操作臺上，接種到不同6-BA濃度梯度的培養基中，每個培養皿接種40 粒種子，用塑料薄膜封口，置于25～26 ℃的避光培養條件下進行愈傷組織誘導培養。出芽后，待芽長至2～3 cm，將芽從基部拔斷去除，將種子留在培養基上，在25～26 ℃避光培養。

1.5 試驗處理

附加了4.0 mg/L 2,4-D的MS基本培養基上，設置了0、0.1、0.2、0.3和0.5 mg/L 5個不同6-BA濃度作為試驗處理，研究了夜影、蒙特利Ⅲ、高帽和德比極品的愈傷組織誘導率。每個培養皿接種40顆種子，以每一培養皿為1個處理，各處理重復4次。

1.6 愈傷組織觀察及記錄

不同品種的多年生黑麥草種子消毒后，分別接種于誘導愈傷組織的不同濃度梯度的培養基中，接種7 d 后開始統計種子的發芽率和出愈率，每隔5 d 統計1 次，記錄數據。按如下公式和標準記錄各處理的發芽率和出愈率：

發芽率(%)= 發芽種子數/接種數×100%

出愈率(%)= 愈傷組織不再變化后的愈傷組織塊數/接種數×100%

1.7 數據統計與分析方法

對各組培處理的發芽率、出愈率等數據，采用Excel和SPSS統計分析軟件分別進行統計分析和顯著性測驗。

2 結果與分析

2.1 不同濃度6-BA對多年生黑麥草發芽率的影響

先將經過消毒處理的4個多年生黑麥草品種的種子接種到附加不同濃度6-BA的培養基上，7 d暗培養，種子開始發芽，統計發芽率(表1)。

在6-BA濃度為0 mg/L的培養基中，4個品種成熟種子的發芽率除了T能達到50.6%之外，其他都低于50%，發芽率很低。隨著6-BA濃度的增加，培養基中種子的發芽率相對增加，對于E品種來說，最高的發芽率達95.0%。在6-BA濃度為0.2 mg/L的培養基中，4個品種成熟種子的發芽率相同且處于較高水平(80%以上)。而后，Dx和T兩個品種的發芽率有所下降，E和M兩個品種的發芽率相對增加。說明6-BA有促進黑麥草種子萌發的作用。

Dx品種在6-BA濃度為0.2 mg/L時的發芽率顯著高于0，0.1和0.5 mg/L濃度處理，高于0.3 mg/L濃度處理的發芽率但不顯著(表1)。T品種在6-BA濃度為0.2 mg/L時的發芽率顯著高于其他4個濃度處理。而E和M品種的發芽率在6-BA濃度為0.2、0.5 mg/L時的發芽率顯著高于其他2個處理。

表1 不同濃度6-BA處理下多生黑麥草的發芽率

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

因此，誘導T和Dx品種成熟種子萌發的6-BA濃度以0.2 mg/L為佳；誘導E和M品種成熟種子萌發的6-BA濃度0.2、0.5 mg/L時都適宜，推薦選用低濃度以節省成本。試驗還觀察到愈傷組織的形成晚于芽的產生，能產生愈傷組織的種子，一般不萌芽或者芽的伸長生長慢于未產生愈傷組織的種子。

2.2 6-BA對多年生黑麥草不同品種出愈率的影響

由于不同品種的基因型不同，愈傷組織的誘導效應也不同，試驗表明，同一種類的不同品種間，其外植體對同一培養基的反應存在差異。因此，要得到再生能力較強的品種，首先要對多年生黑麥草品種篩選。

E品種在6-BA濃度為0.1、0.3 mg/L時的出愈率顯著高于0和0.5 mg/L處理(圖1)，而在這3個濃度處理之間的出愈率沒有顯著的差異。其愈傷組織的平均出愈率最大值為58.1%。因此，E品種愈傷組織誘導的最適濃度為0.1、0.3 mg/L。

Dx品種在6-BA濃度為0.2和0.3 mg/L時的出愈率分別顯著高于0和0.5 mg/L處理，高于0.1 mg/L濃度處理的出愈率，但差異不明顯，其愈傷組織的平均出愈率最大值為73.1%。因此，Dx品種愈傷組織誘導的最適濃度為0.2和0.3 mg/L。

圖1 不同濃度6-BA處理下各品種的出愈率

M品種在6-BA濃度為0.1 mg/L時的出愈率顯著高于0，0.2和0.5 mg/L處理，高于0.3 mg/L處理的出愈率但差異不顯著。其愈傷組織的平均出愈率最大值為71.3%。因此，M品種愈傷組織誘導的最適濃度為0.1 mg/L。

T品種在6-BA濃度為0.1和0.2 mg/L時的出愈率分別顯著高于0和0.3 mg/L，高于0.5 mg/L濃度處理的出愈率但不顯著。其愈傷組織的平均出愈率最大值為72.5%。因此，T品種愈傷組織誘導的最適濃度為0.1和0.2 mg/L。

4個品種的多年生黑麥草成熟種子由于基因型的不同，其愈傷組織的誘導率不同，而且6-BA對愈傷組織的誘導率的影響也不同。

在0和0.1 mg/L低濃度的6-BA處理下，4個品種成熟種子的出愈率之間沒有顯著差異，4個品種的種子對6-BA的敏感度相似。隨著6-BA濃度的增加，在0.2 mg/L時，Dx和T品種的出愈率顯著高于E和M品種，而Dx和T品種之間沒有顯著差異；在0.3 mg/L時，Dx品種的出愈率顯著高于其他3個品種(圖2)。由此可見，在6-BA濃度增加后，每個品種對于6-BA的敏感度存在差異性，Dx品種對于6-BA濃度的敏感性最弱，出愈率受其影響最小，其次是T品種。因此，多年生黑麥草的基因型對其成熟種子的出愈率存在一定的影響。

圖2 不同濃度6-BA處理下各品種的出愈率

3 討論與結論

3.1 討論

愈傷組織誘導中，愈傷組織誘導率取決于品種基因型、誘導培養基附加激素等多種因素相互影響、相互作用。首先，選擇適宜的培養基附加激素濃度是提高愈傷組織誘導頻率，獲得高質量愈傷組織的基礎。

試驗是在已有4.0 mg/L 2,4-D的誘導培養基中加入少量的6-BA，研究不同6-BA濃度對多年生黑麥草出愈率的影響。段碧華等[14]、馬彩云[15]、丁路明[16]的研究報道，在培養基中添加少劑量的6-BA可以增加愈傷組織出愈率。

高濃度的6-BA對愈傷組織誘導起抑制作用，隨著6-BA 濃度的增加抑制作用越明顯。這與楊茹等[8]、梁華等[17]的研究結果相一致。但與其他人的結論有著差別，這可能與所用的黑麥草品種有關。因為試驗發現對于Dx品種而言，6-BA 濃度在0.2、0.3 mg/L比較適宜。因此，還需要做進一步的研究。

吳蓮蓉等[7]的研究表明，黑麥草的發芽率與6-BA的濃度相關不明顯，與其出愈率也無相關。而試驗得出，多年生黑麥草成熟種子的發芽率在0.2和0.3 mg/L濃度時最大，與出愈率有一定的關系。因此，需要進一步研究6-BA的濃度對種子發芽率是否有促進作用，還有發芽率與出愈率之間的關系。

試驗的誘導培養基中，加入了肌醇和水解酪蛋白(AHC)。肌醇能促進愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成，對組織和細胞的繁殖、分化有促進作用，對細胞的形成也有促進作用，而水解酪蛋白則可以促進胚性愈傷組織的誘導[18]。崔凱榮等[19]認為，加入水解酪蛋白對誘導胚狀體起關鍵作用。因此，肌醇和水解酪蛋白的濃度是否對愈傷組織的誘導存在影響則需要其他試驗來研究。試驗選用次氯酸鈉對植物材料進行消毒，其對植物材料和試驗人員的損傷小，且滅菌效果好。然后采用磁力攪拌，使種子與次氯酸鈉充分接觸，種皮脫落，利于種子萌發出芽以及愈傷組織形成。但由于品種之間的差異，不同品種種皮脫落的程度不同，可能對試驗結果造成一定的影響。

3.2 試驗結論

(1) 在一定的濃度范圍內，6-BA 能夠提高多年生黑麥草愈傷組織的出愈率，但隨著濃度的增加反而會降低黑麥草愈傷組織的出愈率。在不考慮4個多年生黑麥草品種的差異性的情況下，0.1 mg/L處理為最適宜的多年生黑麥草愈傷組織誘導的6-BA濃度。

(2)Dx品種對于6-BA濃度變化的敏感性最弱，出愈率受其影響最小，其次是T品種。Dx品種的愈傷組織誘導率比其他3個品種的高，而E品種的愈傷組織誘導率是4個品種中最低的。

(3)E品種誘導成熟種子萌發的6-BA濃度在0.2～0.5 mg/L時都適宜，而誘導愈傷組織的濃度在0.1～0.3 mg/L；誘導Dx品種成熟種子萌發的6-BA濃度以0.2 mg/L為佳，而誘導愈傷組織的濃度在0.2～0.3 mg/L時都適宜；誘導M品種成熟種子萌發的6-BA濃度在0.2～0.5 mg/L，而誘導愈傷組織的濃度以0.1 mg/L為佳；誘導T品種成熟種子萌發的6-BA濃度可選擇0.2 mg/L，而誘導愈傷組織的濃度可在0.1～0.2 mg/L。

綜合本次試驗的結論，誘導多年生黑麥草品種愈傷組織最佳6-BA濃度夜影在0.1、0.3 mg/L，德比極品在0.2、0.3 mg/L，蒙特利Ⅲ為0.1 mg/L，高帽在0.1、0.2 mg/L。能產生高出愈率的為德比極品。

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