鮑曼不動桿菌耐藥基因及插入序列遺傳標記的研究

曹曉君 李小燕

[摘要] 目的 通過對鮑曼不動桿菌的耐藥基因和插入序列遺傳標記進行研究來了解鮑曼不動桿菌的耐藥機制，為臨床治療性用藥、提供臨床療效提供實驗依據。 方法 通過細菌藥物敏感試驗檢測鮑曼不動桿菌對抗菌藥物的耐藥情況，通過PCR方法檢測鮑曼不動桿菌的攜帶β-內酰胺類藥物耐藥基因的狀況以及插入序列遺傳標記的情況。 結果 細菌藥物敏感試驗檢測結果是鮑曼不動桿菌對多種抗菌藥物均耐藥，共檢出TEM、OXA-2、ADC、CTX-M-1、CTX-M-2、IMP、OXA-24等耐藥基因，插入序列遺傳標記ISabal、IS26、tnp513檢出率分別為80.43%和47.82%、52.17%。 結論 β-內酰胺酶基因廣泛存在于鮑曼不動桿菌中，是鮑曼不動桿菌對目前臨床常用的β-內酰胺類藥物存在多重耐藥的主要原因。多重耐藥鮑曼不動桿菌的耐藥性與插入序列遺傳標記有一定的相關性。

[關鍵詞] 鮑曼不動桿菌；多重耐藥；β-內酰胺類藥物；插入序列

[中圖分類號] R446.5???[文獻標識碼] B???[文章編號] 2095-0616（2014）11-122-05

A study on drug resistance gene and genetic markers of insertion sequence of acinetobacter baumannii

CAO?Xiaojun??LI?Xiaoyan

Clinical Laboratory,the Fourth Affiliated Hospital of GZMU,Guangzhou 511447,China

[Abstract] Objective To study the drug resistance gene and genetic markers of insertion sequence of acinetobacter baumannii,so as to understand the resistance mechanisms of acinetobacter baumannii and provide experimental evidence for clinical medication and clinical curative effect. Methods Drug sensitivity tests were carried out to test the drug resistance of acinetobacter baumannii towards anti-bacterial drugs. PCR was applied to test the drug resistance gene of β-lactam antibiotics carried by acinetobacter baumannii as well as test the genetic markers of insertion sequence. Results The results of drug sensitivity tests showed that acinetobacter baumannii is resistant to various kinds of anti-bacterial drugs.Drug resistance genes,such as TEM,OXA-2,ADC,CTX-M-1,CTX-M-2,IMP- OXA-24,were detected,and the detection rates of genetic marks of insertion sequence, including Isabal, IS26 and tnp513,were 80.43%,47.82% and 52.17% respectively. Conclusion β-lactamase gene is widely distributed in acinetobacter baumannii,which explains the main reason why acinetobacter baumannii has multi-drug resistance towards clinically commonly used β-lactam antibiotics.The drug resistance of acinetobacter baumannii has a certain correlation with the genetic markers of insertion sequence.

[Key words] Acinetobacter baumannii;Multi-drug resistance;β-lactam antibiotics;Insertion sequence

鮑曼不動桿菌（acinetobacter baumannii，A baumannii），常寄居于人體的皮膚、口腔黏膜、呼吸道、泌尿道及自然界的水和土壤中，是惟一能在人類皮膚表面生存的革蘭陰性桿菌，是醫院感染的一種重要病原菌。該菌生存能力強，對消毒劑敏感率低，對抗生素耐藥率高，極易播散流行，主要引起獲得性肺炎，尤其是呼吸機相關性肺炎、尿路感染、菌血癥、創口感染、繼發性腦膜炎等，嚴重危害患者健康，給臨床治療帶來極大困難。越來越多的由鮑曼不動桿菌引起的感染被報道，特別是多重耐藥菌株引起的感染被越來越多的專家所關注[1-3]。本課題以多重耐藥鮑曼不動桿菌為研究對象，了解其對臨床常用抗生素的耐藥情況及其可能的耐藥基因，并對插入序列遺傳標記在細菌耐藥中的作用進行分析。旨在通過對多耐藥鮑曼不動桿菌耐藥機制的探究，為臨床用藥治療多耐藥鮑曼不動桿菌起到一定的指導作用，同時也為開發新的抗菌藥物和發現新菌種拓展思路。

1?材料與方法

1.1?菌株來源

全部菌株來源于我院2013年1～12月臨床住院患者的痰液、腦脊液、尿液及血液等不重復標本中分離的鮑曼不動桿菌，共46株，所有的細菌經VITEK-2自動鑒定系統（BioMerieux）確認。

1.2?實驗儀器和試劑

1.2.1?實驗儀器?包括VITEK2-compact全自動微生物鑒定儀鑒定（法國生物梅里埃公司）、PCR擴增儀（Appiled Biosystem））、水平凝膠電泳儀（Bio-Rad）、凝膠成像及分析系統（北京賽智公司）、全自動ABl3070DNA測序儀（美國ABI公司）、低溫冰箱（Thermo）、超純水分離系統（Pall）、低溫臺式高速離心5810R（Eppendorf公司）等。

1.2.2?實驗試劑?包括（1）藥敏紙片、M-H瓊脂（英國OXOID公司）；（2）TaqDNA聚合酶、dNTPs、蛋白酶K、瓊脂糖（日本TaKaRa公司）；（3）引物合成（上海生工生物有限公司）；（4）DNA分子量Marker（Fements公司）等。

1.3?方法

1.3.1?菌株鑒定?標本的采集與細菌分離培養嚴格按《全國臨床檢驗操作規程》[4]進行。采用法國生物梅里埃公司VITEK2-compact進行菌株鑒定。

1.3.2?藥物敏感試驗?采用K-B紙片擴散法測定鮑曼不動桿菌對抗菌藥物的敏感性。參照美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）2010年的標準判斷結果。12種抗菌藥物分別為頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢西丁、亞胺培南、美洛培南、氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸、阿米卡星、慶大霉素、環丙沙星和四環素。藥敏試驗質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.3.3?制備DNA?將經過全自動細菌鑒定藥敏分析系統鑒定后的鮑曼不動桿菌轉入血平板，經24h培養后，挑純培養菌落置入0.5mL離心管內（內預置200ng/mL蛋白酶K溶液200μL），充分震蕩混勻后進行2h水浴（56℃），然后放入95℃水浴進行10min，離心半徑15000r/min進行30s離心，獲得的上清液作為基因檢測的DNA模板液，放入-20℃冰箱內進行保存備用。

1.3.4?隨機引物PCR擴增選用隨機引物ERICIR（5-ATGTA-AGCTCCTGGGGATTCAC-3）和ERIC2（5-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3）進行PCR反應擴增，在PCR反應擴增完成后在1.5%的瓊脂糖凝膠中放入PCR產物，150V電泳20min后用凝膠成像儀觀察DNA條帶的分布并分析基因型。

1.3.5?擴增引物?應用上海生工生物工程有限公司合成的基因擴增引物[5]，各種靶基因引物序列和目的產物長度見表１。

1.3.6?基因檢測?均為PCR法檢測。PCR擴增體系為：每反應體系Pl、P2引物各lμmol/L，dNTPs各2μL KCL 10mmol/L，（NH4）2SO4是8mmol/L，

表1??PCR引物序列

擴增基因

名稱 引物序列（5→3） 產物長度

（bp）

TEM F TTCGTGTCGCCCTTATTC 535

R TTCGTGTCGCCCTTATTC

SHV F TGCGCAAGCTGCTGACCAGC 305

R TTAGCGYTGCCAGTGCTCGA

OXA-1 F CTGTTGTTTGGGTTTCGCAAG 440

R CTTGGCTTTTATGCTTGATG

OXA-2 F CAGGCGCYGTTCGYGATGAGTT 233

R GCCYTCTATCCAGTAATCGCC

OXA-10 F GTCTTTCRAGTACGGCATTA 822

R GATTTTCTTAGCGGCAACTTA

OXA-20 F TTGATAATCCGATTTCTAGCAC 801

R CTAGTTGGGTGGCAAAGCAT

PER F AGTCAGCGGCTTAGATA 978

R CGTATGAAAAGGACAATC

VEB F GCGGTAATTTAACCAGA 961

R GCCTATGAGCCAGTGTT

GES F ATGCGCTTCATTCACGCAC 846

R CTATTTGTCCGTGCTCAGG

CARB F AAAGCAGATCTTGTGACCTATTC 588

R TCAGCGCGACTGTGATGTATAAAC

CTX-M-1 F ATGGTTAAAAAATCACTGCGYCAGTTC 876

R TCACAAACCGTYGGTGACGATTTTAGCCGC

CTX-M-2 F ATGATGACGCAGAGCATTCGCCGCTCA 876

R TCAGAAACCGTGGGTTACGATTTTCGC

CTX-M-9 F ATGATGAGACATCGCGTTAAGCGG 876

R TTAATAACCGTCGGTGACGATTTTCGCG

IMP F CGGCCKCAGGAGMGKCTTT 587

R AACCAGTTTTGCYTTACYAT

ADC F GGTATGGCYGTGGGBGTYATTC 739

R CTAAGASTTGGTCRAARGGT

DHA F AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT 405

R CCGTACGCATACTGGCTTTGC

OXA-24群 F CAAGAGCTTGCAAGACGGACT 420

R TCCAAGATTTTCTAGCRACTTATA

ISabal P1：AATGATTGGTGACAATGAAG 372

P2：ATGCAGCGCTTCTTTGCAGG

IS26 P1：ATGAACCCATTCAAAGGCCGGCAT 387

P2：CCGTCGTAACAGCAAAGCTGCATA

Tnp513 P1：ATGTCGCTGGCAAGGAACGC 240

P2：GGGTTCGCTGCGAGGATTGT

MgCL22mmol/L，Tris-HCL（pH9.0）10mmol/L，NP400.5%，BSA0.02%，Taq DNA pol 1U。總反應體積20μL（其中模板液5μL）。PCR擴增熱循環參數為：93℃預變性2min，然后94℃60s、55℃45s、72℃60s，以上反應循環35個周期，最后一個周期時72℃延長2min。擴增產物經2％瓊脂糖凝膠電泳（110V）20min后在紫外凝膠電泳成像儀下觀察，并記錄結果。

1.3.7?耐藥基因序列分析取PCR產物在美國應用生物系統公司提供的ABl3730型毛細管全自動測序儀上進行測序，由上海生工生物工程有限公司協助完成。

2?結果

2.1?藥物敏感試驗的結果

46株鮑曼不動桿菌中對12種抗生素耐藥率為69.57%~100.00%，全部鮑曼不動桿菌對頭孢噻肟、慶大霉素和環丙沙星耐藥，對全部的抗生素均耐藥的31株，對第三、四代頭孢菌素的耐藥率最低為89.13%，對美羅培南和亞胺培南的耐藥率最低為69.57%。46株鮑曼不動桿菌對抗菌藥物的耐藥性見表2。

表2??鮑曼不動桿菌對抗菌藥物的耐藥性

抗菌藥物 敏感株數 耐藥株數 耐藥率（％）

頭孢噻肟 0 46 100.00

頭孢他啶 4 42 91.30

頭孢吡肟 5 41 89.13

頭孢西丁 2 44 95.65

亞胺培南 14 32 69.57

美洛培南 12 34 73.91

氨芐西林/舒巴坦 9 37 80.43

阿莫西林/克拉維酸 10 36 78.26

阿米卡星 3 43 93.48

慶大霉素 0 46 100.00

環丙沙星 0 46 100.00

四環素 1 45 97.83

2.2?基因檢測結果

46株鮑曼不動桿菌β-內酰胺酶的基因PCR擴增結果顯示，TEM、OXA-2、ADC、CTX-M-1、CTX-M-2、IMP、OXA-24、ADC均為陽性。TEM陽性45株，陽性率97.83%（45/46）；OXA-2陽性42株，陽性率91.30%（42/46）；ADC陽性46株，陽性率100%（46/46）；CTX-M-1陽性42株，陽性率91.30%（42/46）；CTX-M-2陽性44株，陽性率95.65%（44/46）；IMP陽性43株，陽性率93.48%（43/46）；OXA-24陽性44株，陽性率95.65%（44/46）；ADC陽性42株，陽性率91.30%（42/46）。對鮑曼不動桿菌PCR產物隨機進行序列測試，并在國際互聯網上對結果進行檢索分析證明基因測序結果與Genbank的序列一致。

2.3?插入序列遺傳標記檢測結果

46株鮑曼不動桿菌的插入序列遺傳標記檢測結果為插入序列遺傳標記ISabal、IS26、tnp513檢出率分別為80.43%和47.82%、52.17%。PCR陽性產物測得序列經BLAST比對，與已在GenBank登錄的序列均相同。見圖1～3。

圖1??ISabal基因部分測序圖

圖2??IS26基因部分測序圖

圖3??tnp513基因部分測序圖

3?討論

鮑曼不動桿菌是醫院獲得性感染的重要病原菌之一[6-8]。該菌生存能力強，對消毒劑敏感率低，對抗生素耐藥率高，極易播散流行。目前，鮑曼不動桿菌的耐藥情況已經十分嚴峻[9-12]。1991年美國報道了對碳青霉烯類藥物耐藥的鮑曼不動桿菌稱之為全球性的標志性事件，之后在世界各地不斷出現。鮑曼不動桿菌耐藥株不斷增多，對臨床常用的抗菌藥物出現多重耐藥性，使臨床的感染率和死亡率不斷上升，給抗生素臨床應用帶來了極大的困難，給臨床感染性疾病的治療帶來極大的困難[13]。因此，了解它的流行現狀、致病性、藥物敏感性及耐藥機制，對于指導臨床治療顯得非常重要。本組藥物敏感結顯示，46株鮑曼不動桿菌中對12種抗生素耐藥率為69.57%~100%，全部鮑曼不動桿菌對頭孢噻肟、慶大霉素和環丙沙星耐藥，對全部的抗生素均耐藥的31株，對第三、四代頭孢菌素的耐藥率最低為89.13%，對美羅培南和亞胺培南的耐藥率最低為69.57%。結果提示：鮑曼不動桿菌對多種抗生素呈現多重重度耐藥，對機體的危害形勢比較嚴峻。臨床治療鮑曼不動桿菌所致的感染性疾病時應注意根據藥物敏感試驗結果選擇敏感的抗生素以提高臨床療效，同時降低抗生素不當應用所導致的鮑曼不動桿菌的耐藥性。

鮑曼不動桿菌耐藥機制[4-16]極其復雜，其耐藥的生化機制主要包括產生金屬氨基糖甙類藥物修飾酶、β-內酰胺酶、青霉素結合蛋白的改變和外排泵出機制、代謝途徑的改變、外膜蛋白的丟失或膜孔蛋白的缺損等。這些細菌耐藥生化機制的產生，主要是因為細菌的耐藥相關基因改變。這種耐藥發生的遺傳基礎大多是可移動遺傳基因片段，如耐藥質粒、插入序列、整合子和轉座子等水平傳播造成的。這些外源性的DNA片段常帶有耐藥基因，可以從一個細菌體轉移至另一個菌體，可以是同菌屬，也可以是異菌屬之間相互傳播，這種轉移可使耐藥菌不斷增多并易于傳遞播散。本組基因檢測結果顯示，46株鮑曼不動桿菌β-內酰胺酶的基因PCR擴增結果顯示，TEM、OXA-2、ADC、CTX-M-1、CTX-M-2、IMP、OXA-24、ADC均為陽性，且陽性率均大于90%。結果提示：本組鮑曼不動桿菌呈現多重耐藥可能與帶有這些可移動遺傳基因片段有關，可移動遺傳基因片段的陽性存在使得鮑曼不動桿菌對多種抗生素呈現多重重度耐藥，增加了臨床對鮑曼不動桿菌所致的感染性疾病的治療難度，降低了臨床療效，帶給患者機體方面的傷害，甚至死亡。

從DNA的原位上單獨復制或斷裂形成的DNA順序片段，環化改變后插入另一位點，并對其后的基因起調控作用，這就是轉座過程。轉座子（transposons，Tn）是指一類在細菌的染色體，質粒或噬菌體之間自行移動的遺傳成分，能將自身基因插入基因組中任何一個在序列上與己無關的新位點的DNA序列。轉座子存在于染色體DNA，是可自主復制和移位的基本基因單位，可導致細菌耐藥性的多樣化，并且易于傳遞散播。最簡單的轉座子不帶有任何宿主基因而常被稱為插入序列，它們是細菌染色體DNA或質粒DNA的正常組成部分。插入序列（IS）是作為最簡單的轉座元件，是細菌染色體和質粒的正常組成成分，為一種可編碼轉座所需酶的轉座子。插入序列不僅移動基因，并可導致被插入基因失活[17-18]。如：ISabl插入至鮑曼不動桿菌碳青霉烯類藥物特異性通道蛋白編碼基因中時，可導致該通道蛋白編碼基因失活而耐碳青霉烯類藥物。轉座子不僅有傳播耐藥基因的功能，而且有使細菌已有耐藥基因高表達能力或破壞細菌本身結構基因而使細菌耐藥。近年已有眾多文獻報道，處于ISabal、IS26、trip513下游的基因可出現高表達現象。近年國內對耐藥菌的整合子研究報道較多，但對轉座子、插入序列的研究報道鮮見。本組插入序列遺傳標記檢測結果顯示，46株鮑曼不動桿菌的插入序列遺傳標記ISabal的檢出率為80.43%，IS26的檢出率為47.82%，tnp513的檢出率為52.17%。結果提示：插入序列的廣泛存在，使得鮑曼不動桿菌的染色體DNA具有較強的自主復制和移位能力，可導致細菌耐藥性的多樣化，也可以通過破壞原有的正常基因而使鮑曼不動桿菌發生變異，以及通過提高細菌已有耐藥基因的表達能力，進一步增加了鮑曼不動桿菌對抗生素的耐藥性，從而導致鮑曼不動桿菌出現易于傳遞散播的多重耐藥的特點。

β-內酰胺酶基因廣泛存在于鮑曼不動桿菌中，是鮑曼不動桿菌對目前臨床常用的β-內酰胺類藥物存在多重耐藥的主要原因。多重耐藥鮑曼不動桿菌的耐藥性與插入序列遺傳標記有一定的相關性。為減少多重耐藥鮑曼不動桿菌株的數量，臨床上應根據藥敏結果有針對性地選擇抗菌藥物，同時應加強抗菌藥物的監管，保護抗生素資源，做到合理用藥，減少盲目用藥，同時為了防止耐藥菌株的傳播應加強消毒隔離管理制度，以達到提高治療疾病的水平的目的。

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（收稿日期：2014-03-18）