益生菌對肝硬化大鼠肝細胞凋亡的干預作用

李延玲 張懷宏 翟玉峰

(南陽市中心醫院，河南 南陽 473000)

肝硬化的發生發展過程中，腸道菌群失衡產生的腸源性內毒素具有重要的作用，兩者相輔相成〔1〕。因此，通過調整腸道菌群以改善肝硬化患者的癥狀、預防肝硬化并發癥的發生等成為研究的熱點。世界衛生組織把益生菌定義為攝取一定數量后能對機體產生有益作用的微生物〔2〕。益生菌已被用于治療多種臨床疾病。本實驗探討益生菌對肝硬化大鼠肝細胞凋亡的干預作用。

1 材料與方法

1.1材料 健康SD雄性大鼠50只，180～250 g，由浙江中醫學大學動物實驗中心提供。益生菌(含雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、腸球菌三聯活菌)，上海信誼藥業有限公司,規格：210 mg/膠囊,含活菌5×107CFU/g(CFU:活菌含量)。四氯化碳(CCl4)，上海申翔化學試劑有限公司；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；TUNEL檢測試劑盒，兔抗鼠Bax抗體、兔抗鼠Bcl-2抗體、磷酸鹽緩沖液均購自武漢博士德生物工程有限公司，PV6003兩步法檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉公司。高速低溫離心機，電熱恒溫水浴箱(上海醫用恒溫設備廠)，電子分析天平，玻璃勻漿器。

1.2肝纖維化動物模型的建立 采用橄欖油將CCL4配制成40%油劑，3 ml/kg皮下注射(首次5 ml/kg)，1次/3 d，連續42 d。并飼以高脂低蛋白食物(玉米面混以0.5%膽固醇)，30%酒精為唯一飲料〔3〕。將50只SD大鼠隨機分為5組：正常組、模型組、益生菌低、中、高劑量組，每組10只。正常組皮下注射橄欖油2次/w，同時每天予等容量蒸餾水灌胃；模型組在造模同時每天予等容量蒸餾水灌服；益生菌高、中、低劑量組在造模同時每天予以益生菌高劑量(2.10×107CFU)、中劑量(1.05×107CFU)、低劑量(0.53×107CFU)灌胃，末次給藥后24 h，股動脈放血處死大鼠，留取血清和部分肝臟組織，進行檢測指標測定。

1.3血清肝功能檢測 按試劑盒操作說明，使用日立全自動生化分析儀測定大鼠AST、ALT水平變化。

1.4肝組織生化指標測定 取少許肝組織，加入預冷生理鹽水勻漿，4 000 r/min，離心10 min，取上清液，根據試劑盒操作說明，檢測SOD和MDA活性變化。

1.5肝組織HE染色 取血后處死大鼠，取相同的肝右葉部位，10%甲磷溶醛固定，石蠟包埋，切片，常規HE染色，光鏡下觀察肝組織的病理學改變。

1.6TUNEL染色檢測肝細胞凋亡 石蠟切片常規脫蠟至水后，阻斷內源性過氧化酶活性，蛋白酶K修復，滴加TUNEL混合液，標記過氧化酶，DAB顯色、復染，脫水透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察凋亡細胞，陽性細胞表現為胞核呈棕黃色。每片隨機選取5個400倍視野，以陽性細胞所占百分比的平均數為凋亡指數(AI)〔4〕。

1.7Bax、Bcl-2免疫組織化學染色 石蠟切片常規脫蠟至水，用3%H2O2滅活內源性酶10 min,行抗原修復后，分別滴加一抗 (山羊抗鼠Bax/Bcl-2多克隆抗體 )，陰性對照以PBS代替一抗，4℃過夜，滴加通用型二抗，進行DAB顯色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以胞質或胞核中出現棕黑色或棕黃色顆粒為陽性細胞。在光鏡下每張切片隨機選取5個400倍不連續視野，運用圖像分析系統測定平均光密度(OD)值，取平均OD值作為測量值。

1.8統計學處理 應用SPSS13.0統計軟件進行F檢驗。

2 結 果

2.1大鼠一般情況 正常組大鼠活動正常，反應靈敏，毛發光澤，體重增長可。其余組大鼠精神萎靡，反應遲鈍，活動減少，體重減輕。

2.2各組血清AST、ALT水平的影響 模型組血清中ALT、AST明顯高于正常組(P<0.05)，說明造模成功。與模型組相比較，益生菌高、中、低劑量組中ALT、AST水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清AST、ALT水平的比較

2.3肝組織中MDA含量、SOD活性的變化 模型組與正常組相比，MDA水平顯著升高，SOD水平明顯下降(P<0.05)，說明建模成功。與模型組相比較，益生菌低、中、高劑量組中MDA含量顯著降低，而SOD含量明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肝組織中MDA、SOD水平的比較

2.4各組肝臟病理組織學變化 正常組肝小葉結構完整，肝細胞索呈放射狀排列，肝細胞無變性壞死，肝竇、匯管區無擴張淤血，未見炎性細胞浸潤。模型組可見肝小葉結構破壞，肝細胞脂肪樣變，可見點狀、灶狀壞死，大量炎性細胞浸潤。匯管區及肝實質內可見纖維組織增生，假小葉形成。與模型組相比，益生菌各劑量組肝組織病變有所改善，其中高劑量組改善最為明顯，肝細胞水腫明顯減輕，肝索結構基本清晰，輕度脂肪樣變，部分匯管區少量纖維組織增生，炎性細胞明顯減少。

2.5各組肝組織Bax、Bcl-2表達的影響 免疫組化結果顯示，正常組可見少量Bax、Bcl-2陽性細胞表達，與正常組比較，模型組中Bcl-2表達降低，Bax表達增強，Bcl-2/Bax明顯降低(P<0.05)；而與模型組比較，益生菌各組肝組織中Bcl-2表達增高，Bax的表達較低，Bcl-2/Bax明顯增加(P<0.05)。見表3。

2.6各組肝細胞凋亡比較 正常組大鼠肝細胞未見或偶見凋亡細胞；模型組大鼠肝細胞凋亡數量明顯增加，呈彌漫性分布；益生菌高、中、低劑量組肝細胞AI(10.19±4.05、15.53±3.16、18.50±4.94)均顯著減輕，以高劑量組最為顯著；明顯高于模型組(28.01±7.42)(P<0.05)，模型組明顯高于對照組(1.28±1.38)(P<0.05)。

表3 各組大鼠肝組織Bax、Bcl-2光密度分析結果

3 討 論

在正常生理情況下，肝臟不僅能清除來自腸道的各種毒素，還能清除腸源性細菌等。但是肝臟功能一旦受損，腸道的微生態即可發生顯著變化，導致腸道屏障功能受損，從而腸道細菌及其各種代謝產物將移位進入腸外器官，過度激活機體免疫系統，引起異常免疫反應，導致肝細胞凋亡、壞死。益生菌具有調節機體免疫系統、抑制腸道致病菌感染以及維持胃腸道菌群平衡的作用。已有研究發現益生菌在人的酒精性肝硬化〔5〕，非酒精性脂肪肝類(NASH)〔6〕；鼠的NASH〔7〕模型及半乳糖胺〔8〕或CCl4〔9〕等多種病因所致的肝臟疾病具有一定的治療作用。

ALT、AST在肝細胞中大量存在，若肝細胞發生壞死，其即可被釋放進入血液循環，其濃度水平在一定程度上可反映肝細胞受損程度〔10〕。 MDA是脂質過氧化的最終產物，可破壞細胞膜結構，導致細胞腫脹、變性、壞死和凋亡。而SOD是機體內存在的超氧自由基清除因子，可以修復自由基對肝細胞造成的損害〔11〕。測定MDA、SOD含量可反映機體內脂質過氧化的程度，間接反映細胞損傷的程度。本實驗結果說明益生菌對肝損傷有一定的保護作用。

凋亡是一種主動性“細胞自殺”的過程，對肝臟疾病的發生發展起著重要的作用〔12〕。研究發現肝細胞凋亡發生時常伴有肝細胞壞死，引發肝損傷，導致肝纖維化〔13〕。Bcl-2和Bax為最主要的凋亡蛋白,其中Bcl-2是抗凋亡蛋白，它可通過抑制氧自由基、與Bax結合形成雜二聚體、改變胞內細胞器的Ca2+流等而抑制細胞凋亡〔14〕。而Bax作為Bcl-2的同源體，可抑制Bcl-2的作用，促進細胞凋亡〔15〕。當細胞內Bcl-2較多時，Bcl-2和Bax的異源二聚體增多，凋亡趨勢減弱；當細胞內Bax較多時，則Bax本身形成的同源二聚體占主導，則易于發生凋亡。Bcl-2/Bax比值對決定細胞是否進入凋亡狀態有重要意義〔16～19〕。本實驗結果表明Bcl-2、Bax參與了肝纖維化的過程。益生菌能抑制或降低促凋亡蛋白Bax的表達，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而抑制和減輕肝細胞凋亡。益生菌在降低轉氨酶，改善肝功能的同時，還能減輕對肝細胞的凋亡，對肝組織起到一定的保護作用。

益生菌作為一種活菌制劑，在治療肝病的同時正確使用，可保持患者腸道微生態平衡，改善肝功能，提高機體免疫力，保護肝臟損傷，對病情的恢復起到積極的作用。益生菌與人體之間的相互關系和作用機制有待進一步研究。

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