白藜蘆醇誘導肺腺癌A549細胞凋亡的機制

劉煥義 趙 煜 張小龍 徐紅玉 蘇小妹 楊 波

(成都軍區總醫院腫瘤科,四川 成都 610083)

在許多植物中都發現有白藜蘆醇(Res)，其可以抑制癌細胞生長，有關Res抑制肺腺癌A549細胞生長作用的報道較少，對其抗腫瘤的確切機制亦不清楚。本研究擬探討Res誘導肺腺癌A549細胞凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 低分化肺腺癌A549細胞由美國Rockville研究所提供，培養于含10%胎牛血清，青-鏈霉素(各100 U/ml)的DMEM培養基中，置37℃ 、飽和濕度、5% CO2培養箱孵育培養。Res購于Sigma公司，用DMSO溶解后保存于-20℃。

1.2Res作用于A549細胞后形態學觀察 將處于對數生長期的A549細胞接種于培養皿中，待細胞長至約80%融合時，分別加入終濃度為25、50、100、200 μmol/L的Res ,同時設DMSO對照組，作用24 h后在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態學變化。

1.34,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)細胞核熒光染色 將處于對數生長期的細胞接種于6孔板中，同步化細胞24 h后，加藥處理24 h，常規收集細胞，棄上清后用80%酒精固定30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，離心，留取少量上清，加入DAPI染色5 min后，再用PBS洗2次，離心去上清，加入適量PBS吹懸，取20 μl滴于載玻片上，中性樹脂封片，熒光顯微鏡觀察。

1.4MTT法檢測細胞增殖活性 將處于對數生長期的A549細胞懸液調整為1×105/L接種于96孔培養板，100 μl/孔，置于37℃、5%CO2培養箱培養。待細胞貼壁，去除培養基，再加入含不同濃度(0、25、50、100、200 μmol/L)Res的培養基，每組設6個平行孔，同時設置DMSO對照組置于37℃、5%CO2培養箱培養24 h后每孔加入MTT溶液20 μl,37℃、5%CO2培養箱繼續培養4 h，小心吸棄孔內培養基，加入DMSO 150 μl/孔,室溫避光振蕩15 min，使結晶充分溶解，于酶聯免疫檢測儀490 nm處檢測吸光度數值(OD值)。細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗孔OD值/6×對照孔OD值)。

1.5Western 印跡檢測凋亡蛋白變化情況 棄去細胞培養液，PBS洗滌細胞3次，細胞刮刀將細胞刮下，離心，加入細胞裂解液〔(10 mmol/L Tris-HCl(pH7.4),150 mmol/L NaCl,0.1%(SDS),100 μg/ml PMSF,0.5%NP-40,0.5%脫氧膽酸鈉〕，4℃冰浴中超聲破碎細胞，4℃放置待細胞膜破碎，反復斡旋后于4℃ 12 000 r/min離心，取上清，蛋白定量后，樣品經SDS-聚丙烯酰氨凝膠(PAGE)分離，蛋白電轉至聚氧偏乙烯(PVDF)膜。將PVDF膜在10%牛奶中封閉1 h，加入1∶1 000的一抗，4℃溫育過夜，洗滌，加入酶標二抗室溫1 h，PVDF膜經化學發光法(ECL)檢測特異蛋白。

1.6統計學方法 應用SPSS13.0軟件進行單因素分析。

2 結 果

2.1細胞形態學觀察 Res作用肺腺癌A549細胞24 h后，在倒置顯微鏡下直接觀察，發現一些細胞形態改變，低濃度Res作用時細胞體積有所增大，但細胞數減少；當增加Res濃度至200 μmol/L時，大量細胞凋亡，呈現為細胞大量漂浮，細胞間隙明顯增大。見圖1。

圖1 Res作用于A549細胞的形態學變化(×200)

2.2DAPI細胞核熒光染色觀察 DAPI是一種DNA特異性染料，與DNA發生嵌入式結合，發出藍色熒光。凋亡細胞的細胞核裂比較明顯，且發生核邊緣不規則、核小體核碎片增加。Res可以誘導肺腺癌A549細胞凋亡，隨著加入Res濃度增加凋亡越明顯，而對照組細胞的細胞核完好無損。見圖2。

2.3MTT檢測Res對肺腺癌A549細胞的細胞毒性 分別給A549細胞加入不同濃度Res(0、25、50、100、200 μmol/L)后，計算出抑制率分別為0%、12.4%、21.6%、51.3%、89.7%，經軟件分析 IC50為 100 μmol/L。

2.4凋亡蛋白的檢測 用0、25、50、100、200 μmol/L Res處理A549細胞24 h后，P53、Bax、Cleaved-Caspase3表達明顯上調，而Bcl-2表達量下降，而且Bcl-2/Bax的比值明顯下降。見圖3。

圖2 熒光顯微鏡觀察Res作用24 h后A549細胞核的形態變化(×1 000)

圖3 不同濃度Res作用A549細胞24 h后，P53、Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase3蛋白表達的Western印跡結果

3 討 論

早期研究表明，Res能通過降低血液中膽固醇、抑制脂質過氧化而減少動脈粥樣硬化、高脂血癥的發生，抑制血小板聚集從而阻止血栓的形成。之后的研究又發現，Res具有抗腫瘤特性，可以抑制人乳腺癌細胞、前列腺癌細胞和急性早幼粒白血病細胞的增殖〔1～5〕。本實驗研究結果提示，Res能夠引起A549細胞形態學變化，明顯抑制細胞的增殖。不同濃度Res作用后，A549細胞體積縮小，細胞的折光性減弱，且隨著Res濃度的增加，細胞形態變化越明顯，對細胞的抑制率也明顯增加。

抑癌基因P53作為多種細胞應激與細胞應答的中間環節，與其上下游的各種調控因子及相關基因共同構成了一個錯綜復雜的信號通路。P53肩負著介導細胞周期阻滯、促進細胞凋亡、維持基因組穩定、抑制腫瘤血管發生等多種功能使命，在整個機體組織細胞的生長、發育、分化過程中起著舉足輕重的作用〔6，7〕。P53不僅可以通過下游基因CyclinB1、14-3-3、GADD45、b99等參與細胞周期阻滯，還可以促進細胞凋亡〔8〕。當DNA損傷過度無法修復時，P53則誘導細胞發生凋亡以清除損傷細胞，其中一種機制為上調凋亡促進因子Bax的表達，下調凋亡抑制因子Bcl-2的表達而實現其促進凋亡作用〔9〕。本實驗結果顯示，Res作用A549細胞后，P53表達量增加，并下調Bcl-2蛋白和上調Bax蛋白的表達來誘導細胞凋亡。Bcl-2/Bax的比值降低，增加了線粒體膜的通透性和細胞色素C的釋放，導致促凋亡基因Caspase3活性增加，啟動細胞內凋亡程序。本實驗中Res作用A549細胞后，Cleaved-Caspase3激活,Res濃度越高激活越明顯。Caspase3家族屬于天冬氨酸蛋白酶，在介導細胞凋亡過程中起著非常重要的作用，其中Caspase3為關鍵的效應分子，它可催化多種細胞內特異蛋白的激活，在凋亡信號轉導的許多途徑中發揮著重要功能〔10,11〕。

綜上，本實驗認為Res是一個有廣泛應用前景的抗癌新藥，其抑制腫瘤細胞生長是治療肺癌的重要機制。

4 參考文獻

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