坐骨神經卡壓對脊髓運動神經元及膠質細胞的影響

張增祥 任 寶 薛金偉 王曉東

(河北大學附屬醫(yī)院骨科，河北 保定 071000)

周圍神經卡壓綜合征是外科常見疾病之一。卡壓早期，神經內缺血、缺氧導致水腫，隨著時間延長，神經束內血管進一步受壓導致神經營養(yǎng)障礙，嚴重的引起瓦勒氏變性、束間黏連及永久性瘢痕，這是影響神經傳導功能原因，也是選擇神經內、外松解及局部藥物治療的依據〔1〕。董震等〔2〕研究表明，大鼠坐骨神經卡壓后脊髓前角運動神經元及神經節(jié)細胞可發(fā)生一系列超微結構改變，并隨卡壓時間延長、卡壓程度加重而加劇甚至死亡，對臨床有很大指導作用。Ramon-Gueto等〔3〕表明神經膠質細胞對受損的神經元有保護和修復作用。本文采用經典坐骨神經慢性卡壓模型〔4〕，于造模后不同時間取材，觀察對應脊髓節(jié)段前角運動神經元細胞及膠質細胞光鏡及超微結構變化。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康清潔SD大鼠50只(180～220 g)，雌雄不限，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2模型制備與分組 經典大鼠坐骨神經慢性卡壓模型的制備〔4〕：1%巴比妥鈉(0.3 ml/100 g)腹腔注射，麻醉后仰臥固定于手術臺板上，左側為實驗側，右側為對照側，雙下肢后外側縱行切口顯露坐骨神經，使用縱行剖開長10 mm、內徑1.2 mm硅膠管于梨狀肌下緣0.5 cm處套在坐骨神經上，9-0無創(chuàng)線縫合3針固定硅膠管，局部慶大霉素0.1ml縫合傷口，對照側只顯露坐骨神經，術后雌雄分籠飼養(yǎng)。分組：按照術后取材時間將成功制作模型大鼠隨機分為5組，分別為12、18、24、30、36 w組，每組10只，光鏡組：n=8，電鏡組：n=2。

1.3取材和檢測指標

1.3.1取材 術后12、18、24、30、36 w，1%巴比妥鈉(0.3 ml/100 g)腹腔注射，開胸、降主動脈插管，下腔靜脈胸段剪開放血，25 U/ml肝素鹽水快速灌注至下腔靜脈流出液體為無色，改用2%戊二醛磷酸緩沖液150 ml灌流，后路取L4～6節(jié)段脊髓。分別于光鏡〔10%多聚甲醛(n=8)和電鏡下觀察(4%戊二醛磷酸緩沖液(n=2)〕固定。

1.3.2檢測指標

1.3.2.1一般情況 傷口愈合情況：有無足底潰瘍及自噬現象；大鼠毛色改變及肌萎縮狀況。

1.3.2.2大體改變 觀察局部坐骨神經卡壓段神經外膜增生及粘連狀況，卡壓近端神經增粗情況；相應脊髓節(jié)段光澤度。

1.3.2.3光鏡觀察 HE、鋨酸染色，光鏡下(×100)計數左右側脊髓前角α運動神經元數目，計算側(左側)與對照側(右側)細胞數目之比(L/R)〔5〕。

1.3.2.4電鏡觀察 手術顯微鏡下選取脊髓前角部位，固定、脫水，包埋、切片，醋酸、枸櫞酸鉛雙染，日立H/7500透射電鏡觀察。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS10.0 for windows軟件包，組內配對t檢驗，組間采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1一般情況 術后實驗動物傷口均Ⅰ期愈合，無感染及自噬現象；8 w后大鼠實驗側毛色發(fā)黃、失去光澤；12 w后，患足展趾功能受限，承重點移至膝關節(jié)，肌肉逐漸萎縮，無足底潰瘍發(fā)生。

2.2大體觀察 模型建立后各時間段脊髓外觀無明顯改變。各組在術后12、18、24、30、36 w均可見神經與周圍粘連，增生結締組織從遠近兩端逐漸包裹硅膠管，卡壓遠、近端神經增粗；30 w時近端增粗明顯，質地變硬，結締組織包裹全部硅膠管，36 w包裹進一步增厚。

2.3光鏡觀察 圖1可見，實驗側與對照側比較，脊髓前角α運動神經元數目在12 w無明顯改變，在18、24、30、36 w分別減少7.46%、12.24%、16.83%、20.98%(P<0.05)(表1)，12、18、24、30、36 w脊髓前角α運動神經元數目之比分別為0.995 9±0.122，0.925 4±0.064，0.877 6±0.068，0.831 7±0.048，0.790 2±0.057。18 w觀察到“衛(wèi)星現象”， 30 w時在lamina Ⅸ前角運動α神經元明顯減少。

2.4電鏡觀察 術后12 w可見線粒體腫脹，內質網擴張，溶酶體數量增多，核仁明顯、染色質分布均勻，呈常染色質狀態(tài)；術后18 w，線粒體腫脹加劇，內質網進一步擴張，溶酶體數量減少，核仁明顯、深染，開始出現染色質邊集，出現異染色體；術后24 w，線粒體內質網數目減少，核仁明顯、深染，異染色質增多，核周隙開始出現增寬，溶酶體數量明顯減少，′衛(wèi)星現象′清晰可見；術后30、36 w，線粒體內質網進一步減少，核仁偏移消失，核周膜模糊，異染色質邊集加重，溶酶體幾近消失，提示細胞功能退化、消失；術后30 w，神經膠質細胞內細胞器明顯減少，細胞膜結構不清，異染色質邊集。見圖2。

圖1 衛(wèi)星現象及前角運動α神經元

表1 實驗側與對照側脊髓前角α運動神經元數目

圖2 電鏡觀察

3 討 論

在周圍神經卡壓后存在逆向軸漿流受阻，如程度輕，早期仍可滿足神經元的需求，神經元并不發(fā)生死亡，僅在超微結構上可發(fā)生一些異常，本實驗研究結果與之一致。分析其原因可能為：周圍神經卡壓程度逐漸加劇，逆向軸漿流受阻不斷加重，導致靶器官對神經的營養(yǎng)作用不斷減弱，而卡壓近端神經側支及神經膠質細胞提供的神經營養(yǎng)因子又不能代償，最終將不能滿足神經元代謝的需要，發(fā)生一系列形態(tài)、生化、代謝、方面的改變，據軸突損傷的程度，這種反應輕重不一，其歸宿為：神經元短期變性后恢復為正常的神經元、神經元潰變 、神經元死亡〔6，7〕。

神經組織由神經元和神經膠質細胞組成，長期以來，人們只注意到膠質瘢痕不利的一面，神經變性通常導致反應性膠質增生，此時膠質細胞數量增加，代謝活動加強，膠質細胞及其突起可包圍損傷和變性的神經結構，最終導致膠質瘢痕形成，膠質瘢痕妨礙神經軸突再生，但神經膠質細胞在神經組織修復與再生都起著十分重要的作用，神經膠質細胞可以合成和釋放多種神經營養(yǎng)因子，如神經生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、層黏蛋白、纖維黏連蛋白以及其他細胞外基質成分，有維持神經元存活和促進神經突起生長作用〔8〕。神經膠質細胞與神經元的交互作用越來越引起人們的關注。許多實驗證明，在神經變性、損傷早期膠質細胞反應性增生可能具有修復功能，本實驗研究發(fā)現在神經卡壓18 w開始出現“衛(wèi)星現象”是對損傷的一種反應。此時膠質細胞釋放神經因子，通過旁分泌作用于受損神經元，維持神經元存活，同時，神經膠質細胞能夠攝取突觸間隙的谷氨酸，再其獨有的谷氨酰胺酶的作用下將谷氨酸轉變成無毒的谷氨酰胺，改善缺血后神經元的存活。晚期，膠質細胞發(fā)揮清道夫作用，清除死亡細胞和碎片占據其殘空間，形成膠質瘢痕，與本實驗發(fā)現結果一致：在神經卡壓30 w時，觀察到脊髓Lamina Ⅸ區(qū)運動神經元幾近消失，代之以神經膠質細胞浸潤，電鏡觀察神經膠質細胞器減少，細胞膜結構不清、異染色質邊集嚴重。究竟在神經損傷后多長時間內膠質細胞可以生成和釋放神經營養(yǎng)因子，持續(xù)多長時間，神經膠質細胞的修復作用何時轉變成抑制性屏障作用有待進一步研究。

4 參考文獻

1紀 青，黃 捷，唐英翰.神經內松解術對周圍神經卡壓作用的實驗研究〔J〕.中華手外科雜志，1996；12：53-6.

2董 震，成效好，顧玉東，等.坐骨神經卡壓對腰脊髓神經元的影響〔J〕.中國修復重建外科雜志，1998；12(2)：113-6.

3Ramon-Gueto A，Corder MI，Santos-Benito FF，etal.Function recovery of paraplegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by a factory ensheathing glia〔J〕.Neuron，2000；(25)：425.

4Macdinnon SE，Dellon AL，Hudson AR,etal.A primate model for chomic nerve compression〔J〕.J Reconstr Microsurg,1985；1(3):185.

5尹宗生，顧玉東.臂叢根性損傷后脊髓前角α運動神經元數目變化的實驗研究〔J〕.中華顯微科雜志，1993；16(1)：41-2.

6Gillardon F，klimaschewski L，Wickert H,etal.Expression pattern of candidate cell death effector proteins Bax,Bcl,BCL-X,andC-jun in sensory and motor neurons following sciatic nerve transection in the rat〔J〕.Brain Res,1996；739(1-2)：244-50.

7Gu Y，Spasic Z，Wu W.The effects of remaining axon on motoneuron survival and NOS expression following axotomy in the adult rat〔J〕.Dev Neurosci，1997；19(3)：244-50.

8Robinson SR，Hampson EC，Munro MN，etal.Unidirectional coupling of gap junctions between neuroglia〔J〕.Science，1993；262(5136)：1072.