siRNA干擾堿性成纖維細胞生長因子表達對肺腺癌A549增殖和克隆特性的影響

白小燕 孟又勝 王秀問 王亞偉

(成都市第五人民醫院呼吸內科，四川 成都 611130)

腫瘤干細胞理論認為腫瘤干細胞是腫瘤發生和復發的根源，它們具有無限的自我更新、增殖、多潛能分化及抗拒化放療等特點，針對腫瘤干細胞的治療才是根本。堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)在人體正常組織和多種腫瘤廣泛表達，bFGF信號通路在腫瘤的發生發展及維持干細胞特性方面起重要作用。因此，本研究應用RNA干擾(RNAi)技術抑制bFGF表達，觀察bFGF信號通路對A549的增殖和自我更新等特性的影響。

1 材料與方法

1.1細胞株與試劑 A549細胞系購自中國科學院上海細胞生物研究所；RPMI-1640購自Hyclone公司產品；胎牛血清(FBS)購自TBD公司； bFGF抗體購自SANTA CRUZ公司；β-actin及OCT-4抗體系Abcam公司產品；辣根酶標記山羊抗兔IG購自中杉金橋公司；RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒均購自碧云天公司；蛋白Marker購自Fermentas公司；ECL發光液購自北京博奧森公司； FGF2-RNA質粒載體購自上海吉凱基因化學技術有限公司；質粒抽提試劑盒購自北京TIANGEN公司；Nano Fectin轉染試劑購自SBI公司；Trizol購自Invitrogen；引物購自上海博尚生物公司。

1.2主要儀器 CO2細胞培養箱(美國Heraus公司)、SWCJ型超凈工作臺(蘇州凈化設備公司)、ELx800酶標儀(美國Bio-TEK公司)、倒置顯微鏡及熒光顯微鏡(日本Olympus公司)、凝膠分析儀(江蘇捷達科技公司)、PTC-200 DNA擴增儀(美國MJ公司)、紫外分光光度計(美國Bekman公司)、低溫高速離心機(美國Dupont公司)、臺式高速離心機及移液器(德國eppendorf公司)、恒壓恒流電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.3方法

1.3.1細胞培養 A549細胞置于含10%胎牛血清，青、鏈霉素各100 U/mL的RPMI-1640培養液中，37 ℃、體積分數為5%的CO2、濕度為100 %的孵箱中培養，每2～3 d傳代。

1.3.2bFGF干擾質粒的構建 以bFGF編碼基因(GenBank ID:NC_000004)的799～819區域為靶序列，設計siRNA干擾序列： 5′-ACTACAATACTTACCGGTCAA-3′，Loop結構為CTCGAG，命名為pGCsiU6/ puro/GFP-bFGF-siRNA,以無關序列5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′作為陰性對照(NC)，此序列不與任何人類基因序列同源，命名為pGCsiU6/ puro/GFP-NC-siRNA。質粒構建及測通等具體工作由上海吉凱基因化學技術有限公司完成。

1.3.3質粒轉染和細胞分組 轉染前1 d制備A549單細胞懸液接種于6孔板，當細胞生長達50%～80%匯合時，按NanoFectinTM說明書步驟分別進行pGCsiU6/puro/GFP-bFGF-siRNA和pGCsiU6/puro/GFP-NC-siRNA質粒轉染。轉染48 h后，按1∶5傳代，細胞貼壁良好后加入1 mg/ml嘌呤霉素進行篩選，2 w后熒光顯微鏡下挑選多個表達綠色熒光蛋白(GFP)的單一抗性克隆擴增培養，得到穩定表達pGCsiU6/puro/GFP-bFGF-siRNA的A549細胞(干擾質粒組)和穩定表達pGCsiU6/puro/ GFP-NC-siRNA的A549細胞(陰性對照組)。以未轉染的A549細胞作為空白對照組。

1.3.4Real-time PCR檢測bFGF mRNA表達 引物序列設計：bFGF上游引物為5′-AGTGTGTG CTAACCGTTACCT-3′,下游引物為5′-ACTGCCCAGTTCGTTTCAGTG-3′；以GAPDH為內參對照，上游引物為5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′，下游引物5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3′。收集各組細胞，按Trizol說明書提取總RNA，測純度、濃度。按照PrimeScriptTM反轉錄試劑盒合成cDNA，反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。然后按SYBR Green反應條件進行實時PCR反應，條件設定為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環35次，72 ℃再延伸5 min。擴增結束后繪制熔解曲線及擴增曲線，以SDS2.0軟件分析Ct值，將各bFGF Ct值減去GAPDH Ct值得ΔCt值，ΔCt越高，mRNA表達越低，以2-△△CT法計算mRNA相對表達量。

1.3.5Western印跡檢測OCT-4表達 收集用預冷的PBS洗滌3次的細胞，加適量RIPA及PMSF混合液裂解30 min，4 ℃離心5 min，取上清得細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度。SDS-PAGE:蛋白樣品加上樣緩沖液混勻，95 ℃ 5 min變性后取50 μg蛋白上樣，壓縮膠70 V 20 min，濃縮膠100 V 60 min電泳，轉膜后，5%脫脂奶粉封閉2 h，加一抗(OCT-4的濃度為1∶800，內參β-actin為1∶1 000)4 ℃過夜，PBST洗膜3次，每次10 min，加二抗(1∶5 000)室溫孵育90 min，洗膜后進行ECL法發光、顯影、定影。捷達凝膠系統分析各條帶積分光密度值(IOD)，以OCT-4的IOD/β-actin的IOD,計算蛋白相對表達量。

1.3.6CCK-8實驗檢測細胞增殖能力 收集細胞制備細胞懸液，調整細胞濃度為1×104/ml，取100 μl接種7塊96孔板，邊緣孔以PBS填充，同時設置空白孔(培養基和CCK-8，無細胞)，對照孔(培養基和細胞)，置37 ℃，5%CO2孵育過夜，每孔加入10 μl CCK-8溶液，4 h后測定490 nm各孔的吸光度值(A值)，連測7 d,以時間為橫軸，每天的A值為縱軸繪制生長曲線。實驗重復3次。

1.3.7克隆形成實驗 制備單細胞懸液計數，取100個細胞種于35 mm培養皿中，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養2 w，吸除培養液，甲醇固定15 min，吉姆薩染色液染色10 min，PBS洗滌，于顯微鏡下計數克隆數并記錄。克隆形成率(%)=克隆形成數/接種細胞數×100%。

2 結 果

2.1轉染效率的鑒定 轉染48 h后用熒光顯微鏡觀察轉染效率，大于80%。見圖1。

2.2RT-PCR結果 以空白對照組A549細胞的bFGF mRNA表達水平為參照，質粒干擾組及陰性對照組的mRNA相當表達分別為(0.209±0.044)倍及(1.029±0.215)倍，干擾組明顯低于陰性及空白對照組(P<0.01)；陰性對照組和空白對照組間差異無統計學意義。

圖1 熒光顯微鏡下觀察A549細胞的轉染效率

2.3OCT-4蛋白的表達水平 質粒干擾組、陰性對照組和空白對照組OCT-4蛋白相對表達分別為0.440±0.046、0.748±0.102、0.726±0.019，與陰性對照組和空白對照組相比，質粒干擾組的OCT-4蛋白表達明顯下降(P<0.01)。見圖2。

2.4細胞生長曲線圖 第1天各組細胞增殖沒有差別，第2～7天質粒干擾組細胞生長明顯受抑，增殖活力明顯低于陰性對照組和空白對照組(各P<0.01)，陰性對照組和空白對照組間差異無統計學意義。見圖3。

1：空白對照；2：陰性對照組；3：質粒干擾組

2.5抑制bFGF表達對細胞克隆形成能力的影響 圖中單個紫色小點為一個克隆集落，質粒干擾組、陰性對照組及空白對照組細胞克隆形成率分別為(12.25±2.97)%、(42.75±4.50)%、(44.25±3.31)%，質粒干擾組克隆形成能力明顯低于陰性對照組和空白對照組(各P<0.01),而陰性對照組和空白對照組之間差異無統計學意義。見圖4。

與質粒轉染組比較：1)P<0.05,2)P<0.01

圖4 轉染后各組A549細胞的克隆集落

3 討 論

bFGF作為bFGF/FGFR信號通路的關鍵蛋白，由定位于染色體4q 26～27基因編碼，因其上游起始密碼子的不同，可產生分子量在18～34 kD之間的多種異構體，這些異構體通過自分泌、旁分泌或者內分泌的形式分泌，與細胞表面的受體接觸后通過PKC、Ras /Raf/MEK /ERK、PI3K等途徑將信號傳遞至胞內。

腫瘤的發生、發展很多都和細胞信號通路傳導異常密切相關，bFGF/FGFR信號通路作為眾多重要信號通路之一，不僅在維持胚胎干細胞〔1〕、骨髓間充質干細胞〔2〕、神經干細胞〔3〕等正常干細胞自我更新、多潛能分化等特性方面起重要作用外，而且在促進腫瘤細胞增殖、侵襲、耐藥、抗凋亡及腫瘤新生血管形成等方面起重要作用。已有研究表明，bFGF在腦膠質瘤〔4〕、乳腺癌〔5〕、黑色素瘤〔6〕、肝癌等〔7〕多種腫瘤中過表達。Zhao等〔8〕對肺癌組織及正常肺組織行免疫組化發現，80.9%肺癌組織表達bFGF，明顯高于正常肺組織，而且bFGF過表達預示著更差的總生存，說明bFGF在肺癌發生發展中發揮重要作用。

轉錄因子OCT-4已被證實可作為胚胎干細胞的標志物〔9〕,其在干細胞高表達，一旦干細胞分化，其表達迅速下降或不表達。OCT-4對腫瘤形成及發展也起重要作用，這種作用在乳腺癌〔10〕、肺癌〔11〕、前列腺癌〔12〕、口腔癌〔13〕等腫瘤干細胞中得到證實。Meng等〔14〕研究發現A549細胞系中約有45%的為腫瘤始發細胞，它們具有自我復制、成瘤等特性。Vera等〔15〕對多種人癌細胞系進行化療藥物處理，發現存活細胞富集腫瘤干細胞。本研究檢測A549表達OCT-4。

由于bFGF容易變性降解、半衰期極短，限制了bFGF單克隆抗體的使用。而RNA干擾作為一種重要的基因轉錄后沉默技術，其核心原理是將特異性同源雙鏈RNA導入細胞，導致目的基因不表達或表達下降，由于其不影響DNA的復制和轉錄，與反義寡核苷酸干擾技術相比，RNAi具有高度特異性、抑制效率高、可持久傳代等優點，已廣泛應用于基因治療研究〔16〕。本研究通過RNA干擾可以有效抑制肺癌A549細胞中bFGF在mRNA水平的表達。Greber等〔17〕在人胚胎干細胞中發現bFGF通過調節TGF-β受體信號通路而維持Oct-4、Nanog和Sox2的表達，促進干細胞的自我更新，本研究發現bFGF表達抑制后,A549細胞的增殖能力及自我更新能力降低，,推測可能bFGF被抑制后下調OCT-4表達,影響肺癌A549中的干細胞的特性有關。總之，本研究通過應用RNAi技術，不僅有效抑制肺癌A549細胞中bFGF的表達，而且證明bFGF信號通路被抑制可能通過下調OCT-4，抑制肺癌細胞的增殖及自我更新能力等干細胞特性。

4 參考文獻

1Dvorak P,Dvorakova D，Hampl A.Fibroblast growth factor signaling in embryonic and cancer stem cells〔J〕.FEBS Lett，2006；580(12)： 2869-74.

2Schmidt A，Ladage D，Schinklthe T，etal.Basic fibroblast growth factor controls migration in human mesenchymal stem cells〔J〕.Stem Cells，2006；24(7)：1750-8.

3王占堯,曹 磊,姬西團.bFGF和BDNF對小鼠神經干細胞體外增殖分化的影響〔J〕.中華神經外科疾病研究雜志，2010；9(5):435-7.

4Wang DL,Wang YF,Shi GS,etal.Correlation of hTERT expression to maspin and bFGF expression and their significance in glioma〔J〕.Ai zheng,2007；26(6)：601-6.

5Fuksiewicz M,Kowalska M,Kotowicz B,etal.Serum soluble tumour necrosis factor receptor type I concentrations independently predict prognosis in patients with breast cancer〔J〕.Clin Chem Lab Med,2010；48(10)：1481-6.

6Fontijn D,Bosch LJ,Duyndam MC,etal.Basic fibroblast growth factor- mediated overexpression of vascular endothelial growth factor in IF6 human melanoma cells is regulated by activation of PI3K and p38 MAPK〔J〕.Cell Oncol,2009；31(3)：179-90.

7Wang XH,Sun X,Meng XW,etal.Beta-catenin siRNA regulation of apoptosis- and angiogenesis-related gene expression in hepatocellular carcinoma cells：potential uses for gene therapy〔J〕.Oncol Rep，2010；24(4)：1093-9.

8Zhao M,Gao FH,Wang JY，etal.JAK2/STAT3 signaling pathway activation mediates tumor angiogenesis by upregulation of VEGF and bFGF in non-small-cell lung cancer〔J〕.Lung Cancer，2011；73： 366-74.

9Lengner CJ,Welstead GG,Jaenisch R.The pluripotency regulator Oct-4：a role in somatic stem cells〔J〕?Cell Cycle,2008；7(6):725-8.

10Bussolati B,Grange C,Sapio A,etal.Endothelial cell differentiation of human breast tumor progenitor cells〔J〕.J Cell Mol Med,2009； 13(2):309 -19.

11Chen YC,Hsu HS,Chen YW,etal.Oct-4 expression maintained CD133-positivrcell 〔J〕.PLoS One，2008；3(7):e2637.

12Gu G，Yuan J，Wills M，etal.Prostate cancer cells with stem cell characteristics reconstitute the original human tumor in vivo 〔J〕.Cancer Res，2007；67(10)：4807-15.

13Chiou SH,Yu CC，Huang CY，etal.Positive correlation of Oct-4 and Nanog in oral cancer stem-like cells and high-grade ora squamous cell carcinoma 〔J〕.Clin Cancer Res,2008；14(13)： 4085-95.

14Meng X,Wang X,Wang Y.More than 45%of A549 and H446 cells are cancer initiating cells：evidence from cloning and tumorigenic analyses 〔J〕.Onco Rep,2009； 21(4)：995-100.

15Vera Levina,Adele M,Marrangoni A，etal.Drug-selected human lung cancer stem cells：cytokine network,tumorigenic and metastatic properties 〔J〕.PloS One，2008；3(8):e3077.

16Kim DH，Rossi JJ.Strategies for silencing human disease using RNA inter- ference〔J〕.Nat Rev Genet，2OO7； 8(3)： 173-84.

17Greber B,Lehrach H，Adjaye J.Fibroblast growth factor 2 modulates transforming growth factor beta signoling in mouse embryonic fibroblasts and human ESCs(hESCs)to support hESC self-renewal〔J〕.Stem Cells，2007；25(2)：455-64.