人參二醇組皂苷改善內毒素誘導急性腎損傷小鼠腎功能的機制

陳 燕 孟 艷 杜艷偉 于 淇 王曉琴 付 雙 劉蓮勤 方 圓 趙雪儉

(吉林大學基礎醫學院病理生理教研室，吉林 長春 130021)

膿毒血癥誘發的失控性全身性炎癥反應綜合征(SIRS)是導致多器官衰竭的重要原因，而急性腎損傷(AKI)是其中最嚴重的并發癥，致死率極高〔1～3〕。膿毒血癥發生時內毒素(LPS)直接與內皮細胞和白細胞結合，刺激大量細胞因子及自由基的產生和釋放，誘發炎癥級聯反應〔4〕。此過程中，腎臟是受累的主要器官，氧化應激在LPS誘導的AKI中起重要作用。本實驗擬探討人參二醇組皂苷(PDS)改善LPS誘導AKI小鼠腎功能的可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 C57BL/6小鼠由吉林大學實驗動物中心提供。實驗方案通過吉林大學動物倫理審查委員會審核批準。

1.1.2藥物 PDS由吉林大學天然藥物研究室提供，專利號ZL 98 100070.3，使用時用生理鹽水配制。

1.2方法

1.2.1AKI小鼠模型的構建 24只雄性C57BL/6小鼠，隨機分為如下3組(n=8)：對照組、LPS組、PDS+LPS組。對照組經腹腔注射0.5 ml 0.9%氯化鈉。LPS組、PDS+LPS組小鼠分別經腹腔注射LPS 10 mg/kg (大腸桿菌血清型O111：B4，購于英國Sigma公司)。PDS+LPS組小鼠在LPS注射前1 h經腹腔注射PDS(25.0 mg/kg)。脂多糖注射12 h, 戊巴比妥將小鼠深度麻醉后, 取腎臟凍存或固定，備蛋白表達與形態學觀察用，并收集血液用于生化檢測。

1.2.2小鼠腎臟組織HE染色 給予PDS預保護1 h后注射LPS 12 h之后，將各組小鼠處死，并分離腎臟組織，通過HE染色的方法觀察各組腎臟組織形態學變化。

1.2.3TUNEL法檢測腎臟細胞凋亡 按TUNEL試劑盒(DeadEndTM熒光測定系統購于美國Promega公司)說明書操作，檢測腎臟細胞凋亡情況，以腎臟組織出現棕褐色、且著色強度高于背景非特異性染色者判定為陽性。

1.2.4全自動生化分析儀檢測血液生化指標 小鼠的血清樣品離心(3 000 r/min，10 min)，利用診斷試劑盒(均購于南京建成生物科技公司)與全自動生化分析儀(美國，Beckman Coulter LX20)檢測：腎功能標志物〔肌酐(CREA)、尿素氮(BUN)〕、肝功能標志物〔谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)〕。

1.2.5Western印跡方法檢測蛋白表達 將50～100 mg的腎臟組織用液氮研磨成粉末并移至EP管中。將500～800 μl組織裂解液RIPA(含PMSF和蛋白酶抑制劑，購于碧云天公司)加入盛有腎組織粉末的EP管內，于冰上孵育10 min，室溫放置10 min，4℃，12 000 r/min，離心20 min。用微量移液器吸取上清后分裝，保存于-80℃。按照常規方法配制聚丙烯酰胺凝膠，依次進行SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉、抗體孵育、ECL顯色。特異性條帶用上海天能科技有限公司GIS凝膠圖像分析系統進行灰度掃描。

1.2.6檢測腎組織中一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性 腎組織NO含量檢測采用硝酸還原酶法測定，MDA含量檢測采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定，用SOD測定試劑盒檢測腎臟SOD活性；分別用分光光度計在550 nm、535 nm、550 nm處讀數(以上檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所)。

1.2.7檢測腎組織一氧化氮合成酶(iNOS)及Mn-SOD蛋白表達 應用免疫印跡方法檢測腎組織iNOS及Mn-SOD蛋白表達(抗體均購于Abcam，Cambridge，MA，USA)。

1.3統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 結 果

2.1HE染色顯示各組腎臟組織形態學變化 LPS組腎小管上皮細胞腫脹、管腔縮小、腎間質水腫，有炎細胞浸潤；PDS+LPS組與LPS組比較，上述表現明顯減輕。見圖1。

2.2各組小鼠腎臟組織凋亡情況 應用TUNEL方法檢測可見腎臟組織細胞中有棕褐色深染顆粒，說明有細胞凋亡。見圖2。并且LPS組凋亡程度嚴重，PDS+LPS組凋亡程度較LPS組減輕。

圖1 腎臟組織形態學變化(HE染色,×100)

圖2 TUNEL法檢測腎臟組織凋亡(×200)

2.3PDS對腎功能的影響 血清BUN含量 LPS組〔(32.31±1.76)mmol/L〕明顯高于對照組〔(11.83±0.99)mmol/L〕(P<0.01)，而PDS+LPS組的BUN含量〔(24.95±2.61)mmol/L〕顯著地低于LPS組(P<0.05)。血清的CREA含量以LPS組為最高〔(44.15±2.87)μmol/L〕，與對照組〔(16.16±1.43)μmol/L〕比較差異極為顯著(P<0.01)，PDS+LPS組〔(32.60±2.80)μmol/L〕明顯低于LPS組(P<0.05)。

2.4PDS對肝功能的影響 血清ALT活性，LPS組〔(73.29±4.00)IU/L〕與對照組〔(36.37±3.61)IU/L〕比較顯著增高(P<0.01)，PDS+LPS組ATL活性〔(70.09±5.25)IU/L〕與LPS組比較僅有下降趨勢。血清AST水平，LPS組〔(273.14±32.85)IU/L〕極顯著高于對照組〔(90.50±7.53)IU/L〕(P<0.01),PDS+LPS組〔(181.00±16.54)IU/L〕與LPS組比較明顯降低(P<0.05)。

2.5PDS對氧化應激相關指標的影響 LPS誘導AKI小鼠腎組織NO水平急劇增加。LPS組iNOS蛋白表達水平和NO含量與對照組比較明顯增加(P<0.01，P<0.05)，PDS+LPS組iNOS蛋白表達水平和NO含量均顯著低于LPS組(P<0.05)。LPS組腎臟MDA含量與對照組比較明顯增高(P<0.05)，SOD含量和Mn-SOD的蛋白表達水平都明顯低于對照組(P<0.01，P<0.05)。見圖3，圖4。

圖3 PDS對LPS誘導AKI小鼠腎臟NO、mDA含量及SOD活性、Mn-SOD、iNOS表達水平的影響

1.對照組；2.LP組；3.PDS+LPS組

3 討 論

在膿毒血癥致病過程中，活性氧(ROS)主要通過以下途徑產生毒性作用：引起脂質過氧化、激活凋亡通路、調整細胞內鈣濃度、誘導黏附因子表達。氧化應激也可以造成線粒體膜通透性增加，這會導致線粒體內剩余的NAD+減少并伴隨其他基團的產生。超氧化物和NO除了有致病作用，在正常的腎臟和血管中也發揮著生理功能〔5〕。研究表明，在實驗性膿毒血癥AKI的腎損傷是潛在的、可逆的，早期的抗炎和抗氧化劑治療可以改善腎功能〔6〕。

本研究結果說明LPS(10 mg/kg)腹腔注射12 h不僅誘導出AKI，也導致了心、肝等多臟器的損傷；PDS有逆轉多臟器功能損傷的作用。

膿毒血癥性AKI的發病源于對促炎因子的反應，包括細胞因子分泌和活性氮氧化物(RNOS)〔7〕。腎組織氧供除了用于線粒體的呼吸作用，還用于產生ROS和NO。除了有直接的舒血管作用外，經內皮細胞iNOS生成的NO還通過內源的抗炎作用，阻止血管發生功能障礙。正如發生在缺血再灌注損傷和敗血癥時的情形，消耗iNOS相應的輔酶因子會釋放內皮細胞上的iNOS，進而增強ROS的產量〔8〕。細胞產生的過多的NO可以通過競爭氧氣在線粒體中的細胞色素氧化酶抑制線粒體的呼吸作用，這種競爭呈劑量依賴性〔9,10〕。在正常情況下，活性氧被少量釋放并且被內生的抗氧化劑所拮抗，避免氧化應激給組織帶來損傷。氧化應激通常會導致腎細胞通過凋亡通路變性。凋亡誘發的氧化應激和進行性的線粒體功能紊亂是誘發腎病機制的基石。幾項研究共同表明，在急性、慢性腎病的細胞損傷中針對活性氧方面會對設計未來的治療方法有幫助。

Holthoff等〔11〕研究表明，白藜蘆醇通過抑制活性氮自由基(RNS)的活性實現了保護敗血癥性AKI的作用〔12〕。Wu等〔7,12〕研究顯示選擇性iNOS抑制劑(L-N6-(1-Iminoethyl)lysine，L-NIL)減輕了腎小管的氧化應激，并糾正了微循環的異常。本研究發現PDS通過抑制腎臟iNOS表達，減少NO產生與釋放，改善了LPS誘導AKI小鼠的腎功能。MDA是脂質過氧化反應生成的另一種氧化應激的標志物，是氧化強化劑，在其作用下，大量的自由基能損傷DNA、RNA、蛋白質和脂質復合體，而且還會引發突變及凋亡的發生。組織MDA水平可代表組織的氧化應激水平，本研究發現LPS組腎臟MDA含量與對照組比較明顯增高，而PDS+LPS組與LPS組比較MDA水平明顯減少。SOD為清除氧自由基的主要酶，而Mn-SOD為線粒體特異的捕捉氧自由基的酶，本研究發現LPS組SOD含量和Mn-SOD的蛋白表達水平都明顯低于對照組。而PDS+LPS組SOD含量和Mn-SOD的蛋白表達水平都明顯高于LPS組，說明LPS誘導的氧化應激加重AKI小鼠的腎臟功能障礙，給予PDS通過抑制MDA的產生和上調SOD的表達和活性起到了抗氧化應激損傷，保護LPS誘導的AKI腎臟功能的作用。

PDS是從人參莖葉中提取的組合物，水溶性好，藥用價值高，無明顯毒副作用，保障了老年人用藥的安全性。近年有研究表明，PDS 具有抗血小板聚集、降血脂、對抗磷酸二酯酶、抗心律失常、抗心肌缺血、預防感染、提高機體免疫力等作用〔13～16〕。本研究室前期研究表明PDS對內毒素休克大鼠有明顯心肺保護作用〔17～19〕。本研究發現PDS有下調腎組織iNOS表達和上調Mn-SOD蛋白表達、減少NO及MDA生成的作用，從而減輕腎損傷。

綜上，PDS抑制氧化應激可能是其保護LPS誘導AKI小鼠腎功能的機制，其具體的作用途徑仍需進一步研究。

4 參考文獻

1Ve1nkatachalam MA, Weinberg JM. The tubule pathology of septic AKI. A neglected area of research comes of age〔J〕.Kidney Intern,2012;81:338-40.

2Annane D.Corticosteroids for severe sepsis: an evidence-based guide for physicians〔J〕. Ann Intensive Care,2011;1:7.

3Regueira T, Andresen M, Mercado M,etal. 〔Physiopathology of acute renal failure during sepsis〕〔J〕. Med Intensiva,2011;35(7): 424-32.

4Chronopoulos A, Rosner MH, Cruz DN,etal. Acute kidney injury in elderly intensivecare patients: a review〔J〕. Intensive Care Med,2010;36(9):1454-64.

5Deng A, Miracle CM, Lortie M,etal. Kidney oxygen consumption, carbonic anhydrase, and proton secretion〔J〕. Am J Physiol Renal Physiol,2006; 290(5): F1009-F1015.

6Deng A, Miracle CM, Suarez JM,etal. Oxygen consumption in the kidney: effects of nitric oxide synthase isoforms and angiotensin II〔J〕. Kidney Int,2005;68(2):723-30.

7Wu L, Mayeux PR. Effects of the inducible nitric-oxide synthase inhibitor L-N(6)-(1-iminoethyl)-lysine on microcirculation and reactive nitrogen species generation in the kidney following lipopolysaccharide administration in mice〔J〕. J Pharmacol Exp Ther,2007;320(3):1061-7.

8Rabelink TJ, van Zonneveld AJ. Coupling eNOS uncoupling to the innate immune response〔J〕. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2006;26(12): 2585-7.

9Cooper CE, Giulivi C. Nitric oxide regulation of mitochondrial oxygen consumption II: Molecular mechanism and tissue physiology〔J〕. Am J Physiol Cell Physiol,2007;292(6): C1993-C2003.

10Giulivi C, Kato K, Cooper CE. Nitric oxide regulation of mitochondrial oxygen consumption I: cellular physiology〔J〕. Am J Physiol Cell Physiol,2006;291(6): C1225-C1231.

11Holthoff JH, Woodling KA, Doerge DR,etal. Resveratrol, a dietary polyphenolic phytoalexin, is a functional scavenger of peroxynitrite〔J〕. Biochem Pharmacol,2010;80(8):1260-5.

12Wu L, Gokden N, Mayeux PR. Evidence for the role of reactive nitrogen species in polymicrobial sepsis-induced renal peritubular capillary dysfunction and tubular injury〔J〕. J Am Soc Nephrol,2007;18(6):1807-15.

13尤艷利，封穎璐，蔡 青，等. 人參皂苷聯合強的松治療系統性紅斑狼瘡的前瞻性隨機雙盲對照試驗〔J〕. 中西醫結合學報,2010(8): 762-6.

14封穎璐，凌昌全，朱德增，等. 人參皂苷聯合地塞米松防治經動脈化療栓塞術后綜合征的前瞻性雙盲隨機對照研究〔J〕. 中西醫結合學報,2005(2): 99-102.

15封穎璐，凌昌全，陳 喆，等. 人參皂苷聯合地塞米松防治經動脈化療栓塞術后肝腎功能損傷的前瞻性研究〔J〕. 中華腫瘤雜志,2006(11): 844-7.

16林 樺，李 楊，趙雪儉，等. 人參二醇組皂甙對休克細胞的保護作用及其機理的實驗研究〔J〕. 白求恩醫科大學學報,1992(2): 123-5.

17趙 丹，趙雪儉，林 樺，等. 人參二醇組皂甙對失血性休克犬血清5-HT的影響及對血小板的保護作用〔J〕. 中國病理生理雜志,1992(1):50-4.

18趙雪儉，王忠山，趙 丹，等. 人參二醇組皂甙與地塞米松對失血性休克犬心肌收縮性保護作用及機制的探討〔J〕. 中國病理生理雜志,1992(3): 320.

19于振香，彭麗萍，左夢華，等. 人參二醇皂甙對“兩次打擊”全身炎癥反應綜合征大鼠肺CD14和NF-κB表達的影響〔J〕. 中國老年學雜志，2007；27(3)208-10.