甘油果糖氯化鈉注射液滅菌前已灌封樣品的微生物限度檢查法的建立

王林 黃加秀 謝春娟 石晶萍 朱佳麗 周海強 范彪

甘油果糖氯化鈉注射液是高滲制劑, 于1993年在我國批準上市, 通過高滲透性脫水, 能使腦水分含量減少, 降低顱內壓［1］。主要用于腦血管疾病、腦外傷、腦腫瘤、顱內炎癥及其他原因引起的急慢性顱內壓增高、腦水腫等癥的治療［2］。

根據新版GMP要求, 應當依據所用滅菌方法的效果確定滅菌前產品微生物污染水平的監控標準。企業在日常生產過程中應做好微生物的污染水平的監控工作, 對產品含菌量的變化進行趨勢分析, 以便及時發現不良趨勢, 采取相應措施確保產品的無菌水平［3］。這就要求對微生物檢測方法進行驗證以保證方法的可靠性和有效性, 準確了解產品的微生物污染水平［4］。作者在此建立了甘油果糖氯化鈉注射液滅菌前已灌封樣品的微生物限度檢查方法, 并進行了方法學驗證。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 代試品 甘油果糖氯化鈉注射液配制液(批號：13101221、13101421、13101821、13102021, 揚子江藥業集團有限公司)。

1.1.2 試驗用菌種(第四代) 金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63501］、大腸埃希菌［CMCC(B)44102］、白色念珠菌［CMCC(F)98001］、黑曲霉菌［CMCC(F)98003］均來自中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 稀釋液、緩沖液 0.9%無菌氯化鈉溶液(批號：13120141)、pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號：13090221), 均為自制。

1.1.4 培養基 營養瓊脂培養基(批號：1306202)、玫瑰紅鈉瓊脂培養基(批號：1307252)、改良馬丁培養基(批號：1307222)、營養肉湯培養基(批號：130708)、改良馬丁瓊脂培養基(批號：121012)均由北京三藥科技開發有限公司提供。

1.1.5 儀器 HTY-601型智能集菌儀(杭州高得泰林生物技術設備有限公司)；HTY型反復使用全封閉集菌培養器 (杭州高得泰林生物技術設備有限公司)； LRH-250型恒溫培養箱(上海索普儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備 分別接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基, 30～35℃培養18～24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中, 23～28℃培養24～48 h。上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成含50～100 cfu/ml的菌懸液； 接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中, 培養5～7 d, 使大量孢子產生, 加入3～5 ml含0.05%(v/v)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液, 將孢子洗脫, 然后吸出孢子懸液(管口帶有薄的無菌棉花過濾菌絲)至滅菌試管內, 用含0.05%(v/v)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將菌液稀釋至50～100 cfu/ml的菌懸液, 備用。

1.2.2 細菌、霉菌及酵母菌檢查方法的驗證(預實驗 批號：13101221)

1.2.2.1 試驗組 取配制液100 ml至集菌培養器中, 并分別加入50～100 cfu的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌懸液, 過濾, 取出濾膜, 菌面朝上貼至營養瓊脂培養基平板上, 于30～35℃倒置培養3 d。取配制液100 ml, 至集菌培養器中, 分別加入50～100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉菌懸液, 過濾, 取出濾膜, 菌面朝上貼至玫瑰紅鈉瓊脂培養基平板上, 于23～28℃倒置培養5 d。

1.2.2.2 菌液組 方法同試驗組, 不加供試液。測定每一菌株所加的試驗菌數。

1.2.2.3 供試品對照組 照試驗組項下操作, 不加菌懸液,作為供試品本底菌數。回收率的計算公式。

3 結果

細菌、霉菌及酵母菌驗證結果(預試驗回收率%)。見表1。

以上各菌回收率均>70%, 符合規定。故采用3個批號的樣品按照上述方法進行3次獨立試驗。結果見表2。

表1 細菌、霉菌及酵母菌驗證結果(預試驗回收率%)

表2 細菌、霉菌及酵母菌驗證結果(菌株回收率%)

經過3次獨立試驗, 以上各菌的回收率均符合規定, 且長勢相同。故采用該方法再對3批配制液進行微生物限度檢查, 結果見表3。

表3 3批配制液的微生物限度檢查結果(n)

3 小結

為確保無菌藥品的安全有效, 作者在注射液進行最終滅菌前, 對其配制液進行微生物限度檢查, 有效監控其微生物污染狀況。經查閱相關文獻并未發現針對最終滅菌大容量注射劑配制液的微生物限度有明確的限度規定, 為規范無菌制劑生產過程中最終滅菌前產品微生物的質量監控, 保證藥品質量, 本企業制定了甘油果糖氯化鈉注射液滅菌前配制液的微生物限度：細菌、霉菌及酵母菌總數應不得過10 cfu/100 ml。驗證方法建立后, 取3批樣品按此方法檢驗, 檢查結果均符合規定。

［1］于振國, 婁飛云.甘油氯化鈉注射液降低顱內壓52例臨床觀察.蚌埠醫學院學報, 2001, 26(1):23.

［2］丁漢錦.甘油氯化鈉注射液消除腦水腫、降低顱內壓臨床觀察.蚌埠醫學院學報, 2002, 27(6):529-530.

［3］曹元, 梁毅.無菌藥品滅菌前微生物控制研究.中國藥業,2009.18(22):9-11.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部).北京:國醫藥科技出版社, 2010:(附錄)103-107.